Discovery of Biomarkers for Predicting Aggressive Small Renal Cell Cancer

Abstract

Background: Small renal cell cancer (RCC), confined to the kidney and measuring less than 4 cm, is increasingly diagnosed due to the widespread use of imaging tests such as computed tomography and ultrasound. Small RCC is typically slow-growing and has a favorable prognosis; therefore, various guidelines suggest active surveillance as a treatment option. However, some cases exhibit aggressive characteristics such as synchronous metastasis or recurrence. Therefore, markers that can predict aggressive small RCC and help identify patients requiring active treatment are needed. Methods: We obtained formalin-fixed paraffin-embedded samples from five patients with aggressive clear cell RCC (ccRCC) and five with characteristics similar to those of non-aggressive ccRCC who underwent partial or radical nephrectomy between December 2018 and September 2021. Aggressive ccRCC was defined as the one with synchronous metastasis or recurrence. We conducted RNA sequencing and analyzed differentially expressed genes (DEGs) in the samples from 10 patients. Additionally, we selected 50 patients who had undergone surgery for small ccRCCs between January and December 2014. Immunohistochemistry (IHC) was performed to evaluate the association between the expression of prostate stem cell antigen (PSCA; identified as a DEG) and aggressiveness of small ccRCC. IHC results were categorized as follows: the negative group included expression intensities of 0 (negative) and 1 (weak), whereas the positive group included intensities of 2 (moderate) and 3 (strong). Based on the IHC results, we analyzed recurrence-free survival (RFS) according to PSCA expression using the Kaplan–Meier curve and log-rank test. We knocked down PSCA in 786-O cells using small interfering RNA and conducted proliferation, migration, invasion, and colony formation assays. After PSCA knockdown, we evaluated the expression levels of key proteins in the mTOR pathway that are thought to be associated with PSCA. Additionally, we compared the expression of phosphorylated PI3K (p-PI3K), AKT, p-AKT, mTOR, and p-mTOR (key proteins in the mTOR pathway), which is considered a mechanism of PSCA. Results: In total, 418 genes were differentially expressed with absolute fold changes of ≥2 and p-values < 0.05. After adjustment, PSCA expression was shown to be significantly upregulated. The proportion of aggressive small ccRCCs was significantly higher in the PSCA-positive group than in the PSCA-negative group. RFS was poorer in the PSCA-positive group than in the PSCA-negative group. PSCA knockdown in 786-O cells inhibited proliferation, migration, invasion, and colony formation. Additionally, when PSCA was knocked down, the levels of p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, and p-mTOR/mTOR decreased, suggesting that PSCA activated the mTOR pathway, thereby acquiring aggressiveness. Compared with 786-O cells with PSCA knockdown control 786-O cells with upregulated PSCA, showed increased sensitivity to the mTOR inhibitor, everolimus. Conclusions: Our study showed that PSCA might be a potential biomarker for predicting aggressive small ccRCCs. Using RNA sequencing and immunohistochemistry, we found that PSCA upregulation was associated with aggressive small ccRCCs and poor RFS. Functional experiments showed that PSCA knockdown inhibited cancer-related processes such as proliferation, migration, and invasion. Mechanistically, PSCA appears to promote cancer aggressiveness by activating the mTOR pathway, as shown by the reduced levels of p-PI3K, p-AKT, and p-mTOR upon PSCA knockdown. These findings provide insights into ccRCC molecular dynamics and suggest potential therapeutic targets for the PSCA pathway.

작은 신세포암은 컴퓨터 단층 촬영(CT)과 초음파와 같은 영상 진단 검사들이 널리 사용됨에 따라 점점 더 많이 진단되고 있다. 4cm 이하이면서 신장에 국한된 작은 신세포암는 일반적으로 천천히 자라고 예후가 좋은 것으로 알려져 있어, 다양한 가이드라인에서 능동감시를 치료 옵션 중 하나로 제안하고 있다. 그러나, 일부에서는 진단 당시에 원격전이가 진단되기도 하고, 추적관찰 중에 재발을 경험하는 등 공격적 특성을 보인다. 따라서 적극적인 치료와 추적관찰이 필요한 환자를 선별하기 위한 공격적 특성을 갖는 작은 신세포암을 예측할 수 있는 마커가 필요하다. 이에 우리는 투명세포형 신세포암의 공격적 특성을 예측할 수 있는 마커를 탐색하고자 하였다. 2018년 12월부터 2021년 9월까지 T1a 병기의 신세포암으로 수술적 치료를 받은 환자들 중에서 공격적인 특성을 가진 5명의 환자와 공격적 특성을 가지지 않은 5명의 환자로부터 FFPE 샘플을 얻었다. 이 조직들에서 RNA 시퀀싱과 차별 발현 유전자 분석을 수행하였다. 그 후에 2014년 1월부터 12월까지, 우리는 작은 신세포암에 대한 수술을 받은 50명의 환자를 선별하고 PSCA에 대한 면역조직화학 염색을 시행했다. PSCA 발현 정도에 따라 공격적인 작은 신세포암 환자의 비율 차이와 함께, 무재발 생존률을 분석했다. 그리고 신세포암 세포주에서 PSCA 발현을 평가하였으며, 세포주들 중 PSCA 발현이 높은 대표적인 투명세포형 신세포암 세포주인 786-O 세포주를 사용하여 PSCA를 녹다운하였다. 그리고 이에 따른 786-O 세포 증식, 이동성, 침습성 및 콜로니 생성 분석을 시행하였다. PSCA의 기전을 확인하기 위해 mTOR 경로에 존재하는 PI3K, AKT 및 mTOR 단백질의 발현을 비교하였다. RNA 시퀀싱 결과 총 418개의 차별 발현 유전자가 확인되었으며, Benjamini-Hochberg procedure 후에는 PSCA가 작은 신세포암의 공격적 특성과 관련된 차별 발현 유전자로 확인되었다. 50명의 환자 조직에서 면역조직화학염색을 했을 때, PSCA 양성 그룹에서 PSCA 음성 그룹에 비해 공격적 특성을 갖는 비율이 더 높았으며, 무재발 생존률은 더 낮은 것으로 나타났다. 그리고 786-O 세포에서 PSCA를 녹다운하면 세포 증식의, 이동성, 침습성, 그리고 콜로니 생성 능력이 억제되었다. 또한, PSCA가 녹다운될 때, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, 및 p-mTOR/mTOR의 수준이 감소하여, PSCA가 mTOR 경로를 활성화하여 공격성을 획득할 수 있음을 암시하는 것으로 나타났다. 마지막으로 PSCA를 녹다운 했을 때에는 mTOR 차단제인 에버롤리무스에 대한 786-O의 저항성이 증가하는 것으로 나타나, PSCA가 mTOR 차단제 치료의 마커로써의 가능성도 확인하였다. 결론적으로, PSCA는 공격적인 작은 신세포암을 예측할 수 있는 마커인 것으로 보인다. PSCA는 mTOR 경로를 활성화하여 작은 RCC에서 공격적 특성을 갖게 하는 것으로 생각이 되며, mTOR 차단제의 치료 마커의 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.