Therapeutic effect of periostin-binding DNA aptamer on autosomal dominant polycystic kidney disease

Abstract

Background: Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is a genetically inherited disease in which the kidney generates multiple cysts, eventually leading to decline in kidney function. Periostin, a matricellular protein, is highly overexpressed in cyst-lining epithelial cells of ADPKD compared with normal tubule cells. Periostin accumulates in the extracellular matrix adjacent to ADPKD cysts, binds to the αV/β3, αV/β5 integrin ligand, and upregulates the protein kinase B (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway via activation of the integrin-linked kinase (ILK). Aptamers are oligonucleotides that have the ability to inhibit the activity of specific target proteins by binding to proteins. In this study, the therapeutic effect of periostin-binding DNA aptamer (PA) in ADPKD was investigated. Methods: In vitro, WT9-7 cells treated with PA were evaluated for changes in mRNA and protein expression levels of periostin and fibrosis-related molecules, and changes in the degree of ILK pathway activation. Cyst measurements were also performed to compare cyst growth of WT9-7 cells and control treated with PA. In vivo, PKD1 systemic-knockout mice were employed as the ADPKD model. 8-week and 12-week old mice were sacrificed to observe kidney cyst growth. Mice were given intraperitoneal administration of vehicle or PA via intraperitoneal osmotic pumps for a total duration of 4 weeks, starting at postnatal 4 weeks. Changes in cystic disease parameters, expression levels of periostin and fibrosis-related molecules, and changes in the degree of ILK pathway activation after treatment of PA were examined. Results: In the fluorescence-activated cell sorting analysis, Cy3-labeled PA was shown to successfully bind to WT9-7 cells. Treatment of WT9-7 cells with PA (200 nM) attenuated the mRNA and protein expressions of fibrosis-related molecules that included periostin, fibronectin, and type I collagen, without affecting cell viability. This was mediated by attenuation of the AKT/mTOR signaling pathway activated by ILK in WT9-7 cells, as shown by decreased expressions of phosphorylated-ILK, phosphorylated-AKT, phosphorylated-mTOR, and phosphorylated-ERK upon treatment of WT9-7 cells with PA. Additionally, PA ameliorated cell growth in WT9-7 cells. In vivo studies revealed that morphological cystic changes in the kidneys of ADPKD mice were observed as early as 8 weeks. Treatment of PKD1 systemic-knockout mice with PA (500 μg/kg/d) for 4 weeks starting at postnatal 4 weeks ameliorated cyst growth and attenuated the expressions of fibrosis-related molecules. These effects were accompanied by attenuation of ILK pathway activation in the kidneys of PKD1 systemic-knockout mice. Conclusions: This study provides evidence that periostin acts as a key mediator of cyst proliferation in ADPKD, and treatment with a DNA aptamer that binds specifically to periostin may be considered as a modality to slow cyst growth and fibrosis in ADPKD.

배경: 상염색체우성 다낭신 (이하 다낭성 신종)은 신장이 다수의 낭종을 생성하여 결국 신장 기능이 저하되는 유전성 신질환이다. Periostin 은 다낭성 신종의 낭종을 둘러싸는 상피 세포에서 정상 세뇨관 세포에서 발현되는 양에 비해 과도하게 발현되는 세포 기질 단백질이다. Periostin 은 다낭성 신종 낭종 주변의 세포 외 기질에 축적되어, αV/β3, αV/β5 인테그린 리간드에 결합하여 인테그린 연결 키나제 (ILK) 활성화를 통해 단백질 키나제 B (AKT)/mTOR 신호전달 경로를 상향 조절한다. 압타머는 표적 단백질에 특이적으로 결합함으로써 특정 타겟 단백질의 활성을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 연구에서는 다낭성 신종에서 periostin 에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 (PA)의 치료 효과를 평가하였다. 방법: 체외 실험으로, PA 로 처리된 WT9-7 세포에서의 periostin 및 섬유증 관련 분자들의 mRNA 및 단백질 발현 정도의 변화와 ILK 경로 활성화 정도의 변화에 대해 평가하였다. PA 로 치료한 WT9-7 세포와 대조군의 낭종 크기들을 측정하여 낭종 성장을 비교하였다. 체내 실험에서, PKD1 전신적 녹아웃 쥐를 다낭성 신종 모델로 사용하였다. 8주 및 12주령 쥐들은 신장 낭종들의 성장을 관찰하기 위해 희생하였다. 쥐들은 출생 후 4주부터 총 4주간 복강 내 삼투 펌프를 통해 대조약 또는 PA 를 복강 내로 투여 받았다. PA 처리 후 낭종성 질환 매개 변수들의 변화, periostin 및 섬유증 관련 분자들의 발현 수준들의 변화, 그리고 ILK 경로 활성화 정도의 변화를 평가하였다. 결과: 형광 활성화 세포 분류 분석에서 Cy3로 표지된 PA 가 WT9-7 세포에 성공적으로 결합하는 것을 확인하였다. WT9-7 세포에 PA (200 nM)를 처리하면 periostin, fibronectin 및 제1형 콜라겐을 포함한 섬유증 관련 분자들의 mRNA 및 단백질 발현이 억제되었고, 세포 생존도에는 영향을 미치지 않았다. 이는 WT9-7 세포에서 ILK 에 의해 활성화된 AKT/mTOR 신호 경로의 억제를 통해 매개되었으며, 이는 PA 처리 시 인산화-ILK, 인산화-AKT, 인산화-mTOR 및 인산화-ERK 의 발현량 감소로 나타났다. PA 는 WT9-7 세포의 세포 성장을 감소시켰다. 체내 연구에서는 다낭성 신종 쥐들의 신장에서 형태학적인 낭종 변화가 8주부터 관찰되었다. 출생 후 4주부터 4주간 PKD1 전신적 녹아웃 쥐들에서 PA (500 μg/kg/일)를 처리한 결과, 낭종 성장이 감소하였고 섬유증 관련 분자들의 발현이 억제되었다. 이러한 효과는 PKD1 전신적 녹아웃 쥐들의 신장에서 ILK 경로 활성화의 억제와 동반되었다. 결론: 본 연구는 periostin이 다낭성 신종에서 낭종 증식의 핵심 매개체로 작용하며, periostin에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 치료가 다낭성 신종에서 낭종의 성장과 섬유증을 늦추는 방법으로 고려될 수 있다.