Renoprotective effect of haptoglobin and hemopexin by inhibiting ferroptosis in ischemic-reperfusion acute kidney injury

Abstract

Background: Recent studies showed that cell free hemoglobin (CFH) increases in patients with sepsis and after heart surgery, which may cause acute kidney injury (AKI). Since CFH contains catalytically active iron, CFH-related ferroptosis, an iron-dependent form of cell death, may induce AKI. This study investigates the renoprotective effects of haptoglobin (Hp) and hemopexin (Hx), which scavenge CFH, in an experimental AKI model in relation to ferroptosis. Methods: Ischemic-reperfusion injury (IRI) animal models were used as AKI animal models. After 2, 4, 6, 8, and 24 hours, CFH and hemin levels were evaluated in both the control and IRI groups. In addition, the IRI models were treated with different doses (100, 200 mg/kg) of Hp or Hx via intravenous injection 30 minutes after IRI surgery. CFH, hemin, kidney injury markers, and oxidative stress markers, as well as ferroptosis markers were evaluated 24 hours later. Furthermore, kidney injury score was evaluated from kidney tissues based on the percentage of cell necrosis, loss of brush border, cast formation, and tubule dilatation. Quantitative polymerase chain reaction, Western blot analysis, and immunohistochemistry were conducted to assess the mechanism related to ferroptosis. Results: CFH and hemin levels increased in the IRI group at each hour compared to the control. Injection of Hp decreased CFH levels regardless of the dosage, while injection of Hx decreased hemin levels compared to the IRI group. Creatinine, blood urea nitrogen (BUN), neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), malondialdehyde (MDA) levels, and kidney injury score showed increases in the IRI group compared to the control. Treatment with Hp or Hx resulted in decreases in creatinine, BUN, NGAL, MDA, and kidney injury score across all dosages compared to the IRI group. In the IRI group, the mRNA expression of cystine/glutamate antiporter system Xc− (Slc7a11) decreased compared to the control, while ferritin heavy chain 1 (Fth1) increased. However, treatment with Hp or Hx resulted in an increase in Slc7a11 mRNA expression and a decrease in Fth1 compared to the IRI group. Additionally, protein expression and the intensity of immunohistochemistry staining for SLC7A11 and GPX4 exhibited a decrease in the IRI group, which was subsequently ameliorated following the administration of Hp or Hx. In contrast, FTH1 displayed the opposite trend. Conclusions: Hp and Hx may aid as preventive agents for ischemic-reperfusion AKI by inhibiting ferroptosis. 배경: 최근 연구에서 패혈증 및 심장 수술 후 환자의 경우 세포 외 헤모글로빈 농도가 증가하며, 이로 인해 급성 신부전을 유발할 수 있다는 것이 밝혀진 바가 있다. 세포 외 헤모글로빈에는 촉매 활성 철이 포함되어 있어 철 의존적 세포사, ferroptosis가 급성 신손상을 유발할 수 있다. 본 연구는 세포 외 헤모글로빈을 붙잡는 haptoglobin 및 hemopexin의 신장 보호 효과를 ferroptosis와 연관지어 동물 허혈-재관류 급성 신손상 모델을 이용하여 검증하고자 하였다. 방법: 허혈-재관류 신손상 동물 모델에서 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후 세포 외 헤모글로빈 및 헤민 농도를 대조군과 허혈-재관류 신손상군 모두에서 평가하였다. 또한 허혈-재관류 신손상 모델에서 수술 30분 후 꼬리 정맥 주사를 통해 다양한 용량 (100, 200 mg/kg)의 haptoglobin 또는 hemopexin을 투여하였다. 세포 외 헤모글로빈, 헤민 및 신장 손상 표지자, 산화 스트레스 표지자 및 ferroptosis 표지자는 24시간 후에 평가하였다. 또한, 신장 손상 점수는 세포 사멸, 브러시 보더 상실, 캐스트 생성 및 세뇨관 확장의 비율을 기반으로 신장 조직에서 평가하였다. 정량적인 중합 효소 연쇄 반응, 웨스턴 블롯 분석 및 면역 조직 화학 염색을 ferroptosis와 관련된 기전을 평가하기 위해 수행하였다. 결과: 본 연구에서는 허혈-재관류 신손상군에서 시간이 경과함에 따라 세포 외 헤모글로빈 및 헤민 수준이 대조군과 비교하여 증가하였음을 확인하였다. Haptoglobin 주사는 용량과 관계없이 세포 외 헤모글로빈 수준을 감소시켰고, hemopexin 주사는 헤민 수준을 감소시켰다. 크레아티닌, BUN, NGAL 및 MDA 수준은 약제를 투여하지 않은 허혈-재관류 신손상군과 비교하였을 때 증가함을 확인하였다. 또한, haptoglobin 또는 hemopexin 치료는 약제를 투여하지 않은 허혈-재관류 신손상군과 비교하여 모든 용량에서 크레아티닌, BUN, MDA, NGAL 및 신장 손상 점수를 감소시켰다. 허혈-재관류 신손상군에서 시스틴/글루타메이트 반포터 시스템 Xc− (Slc7a11)의 mRNA 발현은 대조군과 비교하여 감소하였으며, 페리틴 단백질 (ferritin heavy chain 1, Fth1) mRNA 발현은 증가하였다. 그러나 haptoglobin 또는 hemopexin 치료 시 Slc7a11 mRNA 발현이 증가하고 Fth1 이 감소하는 결과를 확인하였다. 더불어, SLC7A11 및 GPX4에 대한 단백질 발현과 면역 조직화학 염색의 강도는 허혈-재관류 신손상군에서 감소하였으며, haptoglobin 또는 hemopexin 투여 후 개선되었다. 반면, FTH1은 반대의 경향을 보였다. 결론: 본 저자는 향후 포촉제 단백질인 haptoglobin 및 hemopexin이 ferroptosis를 억제함으로써 허혈-재관류 신손상의 예방제로서 도움이 될 수 있을 것으로 기대한다.