Regulatory mechanism of microglial NLRP3 inflammasome activation in hepatic encephalopathy

Abstract

Background: Along with hyperammonemia, microglia-induced neuroinflammation is a major component in the development of hepatic encephalopathy (HE). The nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome is considered to be an important regulator in neuroinflammation. However, the role of NLRP3 in the pathogenesis of HE is unclear. Meanwhile, mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) have been proposed as a signal for NLRP3 inflammasome activation. Therefore, we aimed to determine whether mtROS-dependent NLRP3 inflammasome activation is involved in HE, using in vivo and in vitro models. Material and methods: For the in vivo HE model, male C57BL/6 mice (12-14 weeks old) were subjected to bile duct ligation (BDL) for 14 days. Liver function tests, liver histology, blood ammonia measurement, and behavior tests were performed to confirm the development of HE. The expression of NLRP3 inflammasome components, NLRP3 inflammasome activation, and pyroptosis were assessed in the hippocampus. Immunofluorescence staining was performed to determine the cellular source of NLRP3 in the hippocampal tissue. For the in vitro experiment, BV-2 microglial cells were primed with lipopolysaccharide (LPS), followed by ammonia treatment. NLRP3 inflammasome activation, pyroptosis, mtROS production, and mitochondrial membrane potential were measured. The mitochondria-targeted antioxidant, Mito-TEMPO, was used to suppress mtROS production. Results: BDL mice showed liver dysfunction, hyperammonemia, decreased movement, anxiolytic-like behavior, and impairment in learning and memory. Both priming (increased protein levels of NLRP3 and pro-interleukin [IL]-1β) and activation (increased protein levels of cleaved caspase-1 and cleaved IL-1β with pyroptosis) steps of NLRP3 inflammasome activation were observed in the hippocampus of BDL mice. Moreover, intracellular ROS levels were increased in the hippocampus, and NLRP3 was mainly expressed in the microglia of the hippocampus in BDL mice. In LPS-primed BV-2 cells, ammonia treatment induced NLRP3 inflammasome activation and pyroptosis, with the elevation of mtROS and altered mitochondrial membrane potential. Pretreatment with Mito-TEMPO suppressed mtROS production and the subsequent NLRP3 inflammasome activation and pyroptosis under LPS and ammonia treatment in BV-2 cells. Conclusions: Hyperammonemia in HE may be involved in mtROS overproduction and subsequent NLRP3 inflammasome activation. Strategies to inhibit NLRP3 inflammasome activation by reducing mitochondrial oxidative stress may be potential targets for attenuating neuroinflammation in HE. Further studies using NLRP3-specific inhibitors or NLRP knockout mice are needed to elucidate the importance of NLRP3 inflammasome in HE development. 배경 : 미세아교세포에서 유발되는 신경염증은 고암모니아혈증과 함께 간성 뇌증 발생의 주요 요인으로 주목받고 있다. 뉴클레오타이드 결합 올리고머화 도메인 유사수용체 단백질3(NLRP3) 인플라마좀은 신경염증 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 NLRP3 인플라마좀이 간성 뇌증 발생에 어떤 영향을 미치는지는 정확히 알려져 있지 않다. 한편, 미토콘드리아 활성산소는 NLRP3 인플라마좀을 활성화시키는 신호들 중에 하나로 알려져 있다. 이 연구에서는 미토콘드리아 활성산소로 인한 NLRP3 인플라마좀의 활성화가 간성 뇌증과 연관이 있는지 동물 모델과 세포 모델을 이용하여 확인하고자 하였다. 방법 및 재료 : 동물 모델은 C57/BL6 수컷 생쥐(12~14주생)에서 담관결찰술 14일을 사용하였다. 간기능검사, 간조직검사, 혈중 암모니아 농도, 그리고 행동실험을 시행하여 간성 뇌증이 발생한 것을 확인하였다. NLRP3 인플라마좀의 발현과 활성화, 그리고 파이롭토시스(pyroptosis)를 뇌의 해마에서 확인했다. 면역형광 염색을 해마 조직에 시행하여 NLRP3가 어떤 세포에서 활성화되는지 확인하였다. 세포 모델은 BV-2 미세아교세포에 지방다당질로 전처치 후 암모니아를 처리 하여 사용하였다. NLRP3의 활성화, 파이롭토시스, 미토콘드리아 활성산소 생성, 그리고 미토콘드리아 막전위를 측정하였다. 미토콘드리아 활성산소 생성을 억제하기 위해 미토콘드리아 특이 산화방지제인 Mito-TEMPO를 사용하였다. 결과 : 담관결찰술을 받은 생쥐는 간기능저하, 고암모니아혈증, 활동성 감소, 항불안 유사 행동, 그리고 학습과 기억 등에서 인지기능의 장애를 보였다. 담관결찰술을 받은 생쥐에서 NLRP3 인플라마좀의 작용 단계인 프라이밍(NLRP3와 인터루킨1베타(IL-1β) 단백질의 증가)과 활성화(활성화 caspase-1과 활성화 IL-1β 단백질의 증가)가 모두 확인되었다. 또한 해마 내에서 세포내 활성산소 수치가 증가하였으며 NLRP3는 주로 해마의 미세아교세포에서 발현되었다. 지방다당질로 전처치한 BV-2 세포에서 암모니아 처리는 미토콘드리아 활성산소 증가와 미토콘드리아 막전위의 변화를 동반하며 NLRP3 인플라마좀의 활성화와 파이롭토시스를 유발하였다. 그러나 Mito-TEMPO를 전처치 한 경우, 미토콘드리아 활성산소 증가와 그에 따른 NLRP3 인플라마좀의 활성화와 파이롭토시스가 억제되었다. 결론 : 간성 뇌증의 고암모니아혈증은 미토콘드리아 활성산소를 과도하게 생성하여 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 유발시킨다. 따라서 간성 뇌증의 치료법으로 미토콘드리아 산화 스트레스를 억제하는 방법을 고려해 볼 수 있다. 그러나 NLRP3 인플라마좀이 간성 뇌증의 발생에 주요 기전인지를 확인하기 위해서는 NLRP3 특이 억제제나 NLRP3 유전자제거 생쥐를 활용한 추가 연구가 필요하다.