Monocyte recruitment in FeCl3-induced carotid thrombosis model in mice and characteristics of stroke patients according to thrombus composition

Abstract

Purpose Inflammatory cells have been suggested to play a role in thrombus formation. However, the role of monocyte in arterial thrombosis and clinical characteristics of patients with monocyte-rich thrombus are less well understood. We investigated the recruitment of monocytes to arterial thrombus over time using the FeCl3-induced carotid thrombosis model in mice and characteristics of stroke patients with higher monocyte composition in thrombus. Materials and Methods After inducing carotid artery thrombosis in Institute of Cancer Research mice using FeCl3, aged thrombus was produced by ligating the distal portion of the carotid artery in mice for 0.5, 1, 2, 3, 6, 24, 48 or 72 hours. For thrombus analysis in stroke patients, we used registry data and thrombi that were obtained during endovascular thrombectomy. Immunohistochemistry was performed to determine thrombus composition, and immunofluorescence was performed to evaluate the expression of extracellular traps and monocyte. Clinical characteristics and outcomes were compared between the higher and the lower monocyte groups, which were categorized based on its median value of monocyte fraction in thrombus. Results In the thrombi of 90 mice, CD68 (monocyte) counts increased from 3 hours and histone H3-positive cell (extracelluar traps) counts increased from 0.5 hour. The counts of both CD68 and histone H3-positive cells increased in a time-dependent manner, and then decreased from 48 hours (both p<0.001). The fraction of monocyte was positively correlated with that of extracellular traps in mouse (r=0.705, p<0.001) and those in stroke patients (r=0.366, p<0.001). In human thrombus, monocyte and extracellular traps were colocalized in confocal immunofluorescence image. In 102 stroke patients, the higher monocyte group showed higher blood platelet counts (median 228×109/L, interquartile range [177 – 267] vs. median 186×109/L, interquartile range [164 – 225], p=0.036), less frequent parenchymal hematoma (8.0% vs. 28.8%, p=0.007), and more frequent functional independence (54.0% vs. 32.7%, p=0.030) than the lower monocyte group. In multivariable logistic regression analysis, the higher monocyte group was associated with functional independence (odds ratio 4.954, 95% confidence interval 1.467-16.724, p=0.010). Conclusion Monocytes and extracellular traps were increasingly recruited early hours and then decreased from 48 hours in arterial thrombosis of mouse model. In both mouse model and human, the fraction of monocytes and extracellular trips showed a positive correlation. Less frequent parenchymal hematoma and more frequent functional independence were observed in the higher monocyte group. Higher monocyte composition in thrombus of stroke patients was an independent predictor of functional independence. 목적 혈전생성에서 혈소판이나 섬유소 이외에도, 백혈구를 비롯한 여러 염증 관련 세포들이 상호작용한다는 것이 최근 많이 보고되었다. 그러나 염증 반응에서의 단핵구의 역할은 잘 알려져 있지만, 혈전생성에서의 역할은 최근에 연구되기 시작하였다. 본 연구에서는 염화제이철을 이용한 경동맥 폐색 마우스 모델을 통하여 시간에 따라 동맥혈전에 단핵구가 동원되는 양상을 살펴보고, 뇌경색 환자의 혈전제거술로부터 얻은 동맥혈전에서 단핵구의 조성에 따른 환자의 특징을 알아보고자 한다. 방법 암 연구소의 쥐에서 염화철을 이용하여 경동맥 혈전을 유도한 후 각각 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 동안 경동맥 원위부를 결찰하여 시간에 따른 혈전을 만들었다. 뇌졸중 환자의 혈전분석에서는 임상 데이터와 동맥내 혈전제거시 얻은 혈전을 이용하였다. 혈전 조성을 확인하기 위해 면역조직화학염색을 하였으며, 세포들의 분포를 확인하기 위해 면역형광염색을 하였다. 결과 90마리 쥐의 혈전에서 CD68 양성 세포 수(단핵구)와 히스톤 H3 양성 세포 (세포외 트랩) 수는 각각 3시간, 0.5시간 이후부터 증가하다가, 두 가지 모두 48시간 이후 감소하였다(p<0.001). 단핵구와 세포외 트랩의 분율은 쥐 모델에서(r=0.705, p<0.001)와, 뇌졸중 환자에서(r=0.366, p<0.001) 모두 양의 상관관계를 보였다. 뇌졸중 환자 혈전의 단핵구와 세포외 트랩은 공초점 면역형광 촬영에서 동일 위치에 있었다. 102명의 뇌졸중 환자들 중 단핵구가 많은 군에서, 혈중 혈소판 농도는 더 높고(중앙값 228×109/L, 사분위간 범위 [177 – 267] vs. 중앙값 186×109/L, 사분위간 범위 [164 – 225], p=0.036), 뇌실질출혈의 빈도는 낮았으며(8.0% vs. 28.8%, p=0.007), 기능적 독립을 의미하는 좋은 예후의 빈도는 더 높았다 (54.0% vs. 32.7%, p=0.030). 로지스틱 회귀분석을 활용한 다변량분석에서 높은 단핵구의 분율은, 기능적 독립을 의미하는 좋은 예후를 예측하는 독립적인 인자였다. (odds ratio 4.954; 95% confidence interval 1.467-16.724, p=0.010). 결론 단핵구와 세포외 트랩은 쥐 동맥혈전 분석에서 처음에는 시간 의존적으로 증가하다가, 48시간 이후부터 감소하는 경향을 보였다. 사람과 쥐 혈전 모두에서 단핵구와 세포외 트랩 분율은 연관을 보였다. 혈전 단핵구 분율이 높은 환자는 혈중 혈소판 농도가 높고, 뇌실질출혈이 적었으며, 기능적 독립을 의미하는 좋은 예후의 빈도는 더 많았다. 뇌졸중 환자들의 혈전에서 높은 단핵구 분율은 기능적 독립을 의미하는 좋은 예후를 예측하는 인자였다.