Development of tough hydrogel for intervertebral disc nucleus pulposus replacement to treat degenerative disc disease

Abstract

Degenerative disc disease is a condition where lower back pain occurs due to degenerative changes in the intervertebral discs. If conservative treatments do not show improvement, surgical interventions such as spinal fusion may be necessary. Tissue engineering, cell therapy, and disc transplantation have been attempted as new treatments for degenerative disc disease, but no successful results have been demonstrated to date. Hydrogel, with its excellent biocompatibility and properties similar to the intervertebral disc nucleus pulposus, has recently gained attention as a potential material for nucleus pulposus replacement. In this study, we aimed to develop a tough hydrogel with enhanced mechanical properties and explore its potential for clinical application as a nucleus pulposus replacement. The tough hydrogel was fabricated by incorporating silk fibers treated with 2-hydroxyethyl methacrylate (2-HEMA), which contains hydrophilic group, into the core of a polyvinyl alcohol (PVA) hydrogel. In vitro experiments were conducted, including cytotoxicity tests, cell adhesion and cell proliferation tests. Cell viability in the extract was assessed, and cell adhesion and proliferation were evaluated through absorbance measurements. Mechanical tests, including swelling, static compression and tensile test, and dynamic mechanical analysis, were performed. Swelling ratio was measured by comparing the weights in dry and wet states, and the elastic modulus and tan δ were measured using an electromechanical testing machine. In vivo experiments were carried out by implanting the tough hydrogel into the intervertebral disc of pigs. Under general anesthesia, surgical incisions were made to remove the pig's lumbar disc nucleus pulposus, and the tough hydrogel was implanted. After 3 weeks, the pigs were sacrificed, and X-ray, micro-CT, and histological analyses were conducted. The cell toxicity test showed that the cell viability in the extract of the tough hydrogel was over 80% of the control group, indicating no cytotoxicity. In cell adhesion test, it exhibited 205% higher absorbance compared to the control group, and cell proliferation tests showed an increasing absorbance difference from the control group over time. Through in vitro experiments, the tough hydrogel demonstrated suitability for cell adhesion and proliferation. The swelling test showed a swelling ratio of 202%, and the compression and tensile elastic modulus were 3.75 kPa and 16.50 MPa, respectively. Tan δ gradually decreased with increasing frequency, converging to 0.09. Mechanical tests confirmed that the tough hydrogel exhibited properties similar to the intervertebral disc nucleus pulposus in terms of elasticity and viscoelasticity. In the pig intervertebral disc implantation surgery, no complications related to the surgery occurred. Histological analysis and imaging results confirmed that the tough hydrogel was located within the intervertebral disc nucleus pulposus, and it integrated well without any adverse reactions to the disc tissue. Through this study, we confirmed that the tough hydrogel possesses excellent biocompatibility and properties, making it a promising candidate for nucleus pulposus replacement in the treatment of degenerative disc disease. For future clinical applications of the tough hydrogel, further research is required to develop minimally invasive and effective implantation methods into the intervertebral disc. 퇴행성 추간판 질환은 추간판의 퇴행성 변화로 인해 요통이 발생하는 질환으로 보존적 치료에 호전이 없을 경우 척추 유합술 등의 수술적 치료가 필요할 수 있다. 퇴행성 추간판 질환의 새로운 치료법으로 조직 공학, 세포 치료, 추간판 이식 등이 시도되었으나 성공적으로 밝혀진 것은 현재까지 없다. 하이드로젤은 생체 적합성이 우수하며 추간판 수핵과 유사한 물성을 보여 추간판 수핵을 대체할 수 있는 소재로 최근 주목받고 있다. 본 연구에서는 물성을 강화한 터프 하이드로젤을 개발하여 추간판 수핵 대체제로서 임상 적용의 가능성을 확인하고자 하였다. 터프 하이드로젤은 실크 섬유를 친수성기를 가진 2-하이드록시에틸메타크릴레이트 (2-HEMA)로 처리한 후 폴리비닐알콜 (PVA) 하이드로젤의 중심부에 배치하여 제작하였다. 시험관내 (in vitro) 실험으로 세포독성시험 및 세포 부착, 세포 증식 시험을 진행하였다. 용출액에서의 세포 생존율을 확인하였고 세포 부착 및 증식 정도를 흡광도를 통해 확인하였다. 물성 시험으로는 팽윤 시험, 정적 압축 및 인장 시험, 동적 기계 분석을 시행하였다. 건조 및 침윤 상태의 무게를 비교하여 팽윤도를 측정하였고 전기역학 시험기를 이용하여 탄성계수, tan δ를 측정하였다. 생체내 (in vivo) 시험으로 돼지의 추간판 내 터프 하이드로젤 주입을 시행하였다. 전신 마취 하에 수술적 절개를 통해 돼지 요추 추간판 수핵을 제거하였고 터프 하이드로젤을 삽입하였다. 3주 뒤 돼지를 희생하여 X-ray, micro-CT, 조직학적 분석을 시행하였다. 세포독성시험 결과 터프 하이드로젤 용출액의 세포 생존율은 대조군의 80% 이상으로 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 세포 부착 시험에서는 대조군 보다 205% 높은 흡광도를 보였고, 세포 증식 시험에서는 시간이 경과함에 따라 대조군과의 흡광도 차이가 증가하였다. In vitro 실험을 통해 터프 하이드로젤이 세포 부착 및 증식에 적합하다는 것을 확인하였다. 팽윤 시험에서 터프 하이드로젤은 202%의 팽윤도를 보였고 압축 및 인장 탄성계수는 각각 3.75 kPa, 16.50 MPa이었다. tan δ는 진동수가 증가함에 따라 점차 감소하여 0.09에 수렴하는 것을 확인하였다. 물성 시험을 통해 터프 하이드로젤이 추간판 수핵과 유사한 탄성 및 점탄성을 가진다는 것을 확인하였다. 돼지 추간판 내 터프 하이드로젤 주입 수술 결과 수술과 관련된 합병증은 발생하지 않았다. 조직학적 분석 및 영상 검사 결과 터프 하이드로젤은 추간판 수핵에 위치하고 있었으며 추간판 조직과 이상 반응 없이 생착한 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 터프 하이드로젤은 우수한 생체 적합성과 물성을 가지고 있음을 알 수 있었고, 퇴행성 추간판 질환 치료를 위한 수핵 대체제로서의 가능성이 충분함을 확인하였다. 앞으로 터프 하이드로젤의 임상 적용을 위해서는 최소침습적이고 효과적인 추간판 내 주입 방법에 대한 추가적인 연구가 필요하다