Damage-associated molecular patterns (DAMPs) as a mechanism of sevoflurane-induced neuroinflammation in neonatal rodents

Abstract

General anesthesia is inevitable for pediatric patients undergoing surgery, though volatile anesthetic agents may cause neuroinflammation and be related to neurodevelopmental impairment; however, the underlying pathophysiology remains unclear. We hypothesized that sevoflurane induces neuroinflammation in the developing brain which is related to specific damage-associated molecular patterns (DAMPs) Therefore, we aimed to investigate the mechanism of neuroinflammation in developing rat brains and their association with sevoflurane exposure time, by identification of the specific DAMP pathway, and evaluate the effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in alleviating neuroinflammation. We conducted a three-step experiment to investigate neuroinflammation induced by sevoflurane. The first step involved determining the exposure time required for sevoflurane to cause neuroinflammation. In the second step, we identified the specific pathway of DAMPs that were involved in neuroinflammation by sevoflurane. Finally, in the third step, we investigated the effects of NSAIDs on sevoflurane-induced neuroinflammation. The expression of various molecules in the rat brain were assessed using immunohistochemistry, immunofluorescence, quantitative real-time polymerase chain reaction, western blot analysis, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). We utilized a total of 112 age of seven days rats for our study, out of which six rats expired during the experiment, resulting in a mortality rate of 5.3%. We observed a significant increase in the expression of CD68; HMGB-1 and galectin-3; and TLR4, TLR9, and phosphorylated NF-κB upon 6 hr sevoflurane exposure. Conversely, the transcriptional levels of TNF-α and IL-6 significantly increased, and IFN-γ significantly decreased after 6 hr of sevoflurane exposure. Co-administration of NSAIDs while sevoflurane anesthesia significantly attenuated TNF-α and IL-6 levels and restored IFN-γ levels. The protective effect of NSAIDs was repeatedly valicated using western blot analysis and serum ELISA. Collectively, the findings suggest that 6 hr sevoflurane exposure induces neuroinflammation through the DAMPs pathway neuropeptides, HMGB-1 and galectin-3, in neonatal rat brains. The co-administration of NSAIDs reduced this sevoflurane-induced neuroinflammation. 소아의 수술에 있어서 전신마취는 필수불가결하다. 흡입마취제의 사용이 신경염증반응과 발달 지연과 연관이 있다는 전임상 연구들이 알려져 있으나 아직까지 그 정확한 기전에 대해 밝혀진 바는 없다. 세보플루란은 소아환자의 마취에 있어서 가장 많이 쓰이는 마취 약제이다. 본 연구에서는 손상 관련 분자 패턴 중 HMGB-1과 galectin-3가 흡입마취제인 세보플루란에 의해 유발되는 신경염증반응을 매개한다고 가정하였다. 본 연구에서는 세가지 단계로 실험을 구성하였다. 첫번째로, 발달 중인 소아 쥐에서 세보플루란 노출 시간에 따른 신경 염증 발생의 정도를 확인하였다. 두번째로는 세보플루란에 의해 유발된 신경 염증과 연관 있는 손상 관련 분자 패턴 인자를 규명하고자 하였다. 마지막으로 세보플루란과 비스테로이스 소염제인 이부브로펜을 함께 투여하여 유발된 신경 염증에 미치는 그 효과를 확인하고자 하였다. 실험 중 소아 쥐의 뇌에서 발현하는 여러가지 인자는 면역조직염색, 면역형광염색, 실시간 중합효소연쇄반응, 웨스턴 블랏, 효소 결합 면역 흡착 검사 등을 이용하여 확인하였다. 총 112마리의 7일된 소아 쥐가 실험에 사용되었고, 그 중 6마리가 실험 중 사망하여 사망률은 5.3%였다. 세보플루란에 의해 신경 염증이 유발되는 노출 시간을 확인하기 위하여 7일된 소아 쥐를 세보플루란에 2시간, 4시간, 6시간에 각각 노출하였을 때, 대조군에 비하여 6시간 노출된 그룹에서 미세아교세포의 활성을 나타내는 분화 클러스터 68의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한 HMGB-1, galectin-3의 발현이 증가하였으며, 그 하위 단계의 수용체로 알려진 톨유사수용체 4와 9, 그리고 인산화 핵인자 카파비의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한 증성 사이토카인인 종양괴사인자 알파와 인터루킨 6의 발현은 증가한 반면, 인터페론 감마의 발현은 감소하였다. 세보플루란의 노출과 함께 비스테로이드 소염제인 이부브로펜을 투여하였을 때, 종양괴사인자 알파와 인터루킨 6의 발현은 감소하였고 인터페론 감마의 발현은 회복되었다. 똑같은 결과를 뇌조직의 웨스턴 블랏을 통해 확인하였고, 혈청 효소 결합 면역흡착검사를 통해 다시 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 6시간의 세보플루란에 노출되었을 때, 발달중인 쥐의 뇌에서는 신경 염증이 유발되었고, 이것은 손상 관련 인자 패턴 중 HMGB 1과 galectin-3에 의해 발생하였음을 확인하였다. 또한 이부브로펜의 투여는 세보블루란에 의해 발생한 신경 염증을 감소시켰다. 추후 다른 마취 약제에 의한 신경 염증 반응의 발생 및 이부브로펜의 용량 등에 대한 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 보인다.