Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cell Inhibits Osteoclast Differentiation Through Tumor Necrosis Factor Stimulated Gene-6

Abstract

Systemic and local bone loss in rheumatic diseases is common and significantly increases the risk of fracture in patients with rheumatic diseases. Mesenchymal stem cells (MSCs) inhibit osteoclast differentiation and activation and seem to be promising in treating these conditions, but the underlying mechanisms remain to be clarified. Tumor necrosis factor activated gene-6 (TSG-6) is a potent anti-inflammatory, tissue-protective molecule that inhibits osteoclast activation. This study aimed to investigate whether TSG-6 mediates the MSC’s inhibition of osteoclast differentiation. Human adipose tissue-derived MSCs (ADMSCs) and bone marrow-derived monocyte/macrophage (BMMs) from DBA/1J or B6 mouse were co-cultured in the presence of M-CSF 10 ng/mL and RANKL 10 ng/mL. In some groups, ADMSCs were transfected with siRNA targeting TSG-6 or osteoprotegerin (OPG). Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity in culture supernatant and mRNA expression of osteoclast markers were investigated. TRAP+ multinucleated cells and F-actin ring formation were counted. ADMSCs significantly inhibited osteoclast differentiation under osteoclastogenic conditions, but pretreatment with TNF-α did not enhance the anti-osteoclastogenic effect of ADMSCs. Suppression of TSG-6 significantly reversed the inhibition of osteoclast differentiation in a degree similar to that of OPG based on TRAP activity, mRNA expression of osteoclast markers, and numbers of TRAP+ multinucleated cell and F-actin ring formation. This study demonstrated that ADMSCs inhibit osteoclast differentiation through TSG-6 under osteoclastogenic conditions, which did not necessitate pretreatment of ADMSCs with TNF-α. 류마티스 질환에 이환된 환자에게 국소 및 전신성 골소실은 흔히 발생하는 합병증으로 이들 환자들은 일반인보다 약 2배 이상 골절 위험이 증가되어있다. 류마티스 질환과 연관된 골소실은 각종 신체 기관의 염증 반응과 receptor activator of the nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)의 증가로 인해 파골세포는 활성화되고 조골세포는 억제되어 발생하는 것으로 알려져 있다. 중간엽 줄기세포는 염증성 미세환경에 노출될 경우 염증을 억제할 뿐만 아니라 파골세포의 분화와 활성화를 억제하는 것으로 알려져 있고 많은 전임상 실험에서 골다공증의 치료에 유용함이 보고된 바 있다. 그러나 중간엽 줄기세포의 골세포에 대한 작용의 정확한 기전에 대해서는 더 많은 연구가 필요하다. Tumor necrosis factor activated gene-6 (TSG-6)는 중간엽 줄기세포를 포함한 다양한 세포들에서 분비되는 물질로서 염증 환경에 노출될 경우 염증을 억제하고 조직을 보호하는 기능이 있다. 본 연구에서는 중간엽 줄기세포가 파골세포의 분화, 활성화를 억제함에 있어 TSG-6의 역할을 규명하고자 하였다. 인간 지방세포 유래 중간엽 줄기세포와 DBA/1J 및 B6 mouse에서 얻은 골수 유래 단핵구/대식세포 (bone marrow-derived monocyte/macrophage)를 파골세포 분화 유도 환경 (M-CSF 10 ng/mL 및 RANKL 10 ng/mL)에서 공배양하였고, 공배양 그룹 중 일부 그룹에서 인간 지방세포 유래 중간엽세포들은 TSG-6 및 osteoprotegerin (OPG) 유전자 발현 억제를 위해 siRNA transfection을 시행하였다. 공배양 중 공배양 2,3,4,5일째의 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 활성도를 측정하였고, 공배양 종료 후 파골세포 분화 연관 유전자들의 mRNA 활성도, 웨스턴 블롯, TRAP 염색 양성 다핵 세포 및 F-actin ring 형성을 평가 및 비교하였다. 실험 결과, TRAP activity, 파골세포 분화 연관 유전자들의 mRNA 활성도, TRAP 염색 양성 다핵 세포, F-actin ring number를 바탕으로 확인한 바, 인간 지방세포 유래 중간엽 줄기세포는 파골세포 분화 유도 환경에서 파골세포 분화를 억제하였고, siRNA transfection을 통해 인간 지방세포 유래 중간엽세포의 TSG-6 유전자를 억제할 경우 이러한 파골세포 분화 억제능이 소실되었다. 본 연구를 통해 인간 지방세포 유래 중간엽 줄기세포는 TSG-6를 분비함으로써 파골세포의 분화를 억제함을 확인할 수 있었고 류마티스 질환에 동반된 전신성 및 국소성 골소실의 치료에 있어 인간 지방세포 유래 중간엽 줄기세포가 유용할 수 있음을 추정할 수 있다.