Unraveling immunomodulatory mechanism of mesenchymal stem cell derived secretome in mouse models of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) exert immunomodulatory and anti-inflammatory effect to several diseases and immune cells, but they have several limitations as a therapeutic agent. Secretome, secreted bioactive molecules, derived from MSCs is proposed as an alternative to overcome the limitations. Among several diseases, autoimmune diseases, result from the defect in immune system, are one of the targets for applying MSCs as a new treatment to cover present unmet needs. Macrophages have function in homeostasis with regulating immune systems and express two functional phenotypes, classically activated M1 and alternatively activated M2 macrophages. Recently, the importance of M2 subtypes, M2a, M2b, M2c, and M2d, is emerging to understand detailed mechanisms of macrophages. Several recent studies tried to clarify therapeutic efficacy and its mechanisms of MSCs; however, it is not fully understood. In this study, the therapeutic efficacy of MSCs derived secretome was observed and the underlying mechanism was studied with searching materials of immune modulation from secretome. For in vitro assay, a macrophage cell line, RAW264.7 cells and mouse peritoneal macrophages were treated with adipose derived MSC (ADSC) secretome in the absence or presence of LPS stimulation. Pro-inflammatory markers and anti-inflammatory markers of macrophages were analyzed with flow cytometry (FACS), qRT-PCR, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). To identify the mechanism of ADSC secretome, NF-κB/AKT and STAT/SOCS pathways of macrophage were observed by western blot. Therapeutic efficacy of ADSC secretome was confirmed with animal models of rheumatoid arthritis, collagen induced arthritis (CIA) and of systemic lupus erythematosus (SLE), NZB W/F1 mouse. ADSC secretome was analyzed by LC/MS-MS proteomics and DAVID bioinformatics. Antibody neutralization and recombinant protein were used to confirm pivotal molecules in ADSC secretome. ADSC secretome suppressed pro-inflammatory markers such as iNOS and TNF-α and enhanced anti-inflammatory markers such as Arg-1 and IL-10 of macrophages. ADSC secretome also suppressed phosphorylation of NF-κB and AKT with the increase of PTEN expression of macrophages. Also, a PTEN inhibitor diminished the immune-modulatory effect of ADSC secretome. Phosphorylation of STAT1 was reduced and of STAT3 was escalated with activation of SOCS1 and SOCS3 by ADSC secretome. ADSC secretome alleviated disease activity of CIA and NZB/W F1 mouse and made peritoneal macrophages express M2b/c-like phenotype. From the proteomics analysis, 84 proteins were discovered in ADSC secretome and 7 candidate molecules (ANAX1, CFH, DKK3, LGALS3BP, PTX3, PROS1, and SERPINF1) were selected. Among them, pentraxin-3 (PTX3) was chosen for the further examination. Antibody neutralization of PTX3 reduced the function of ADSC secretome and recombinant PTX3 showed similar effect with ADSC secretome. ADSC secretome regulated inflammation in RAW264.7 cells and animal models of RA and SLE. Also, ADSC secretome was involved in M2b/c polarization of peritoneal macrophage and PTX3 is a key molecule of the effect. 중간엽 줄기세포는 면역조절 능력과 항염증 능력을 다양한 질병들과 면역 세포들에 나타낸다. 하지만 그들은 치료제재로서의 한계들을 가지고 있다. 중 간엽 줄기세포에서 분비되는 생체 활성 물질들인 분비 인자는 중간엽 줄기세포의 이러한 한계들을 극복하기 위한 대체재로써 제안되고 있다. 면역체계의 결함으로 발생되는 자가면역 질환들은 중간엽 줄기세포를 미충족 수요를 해결하기 위한 새로운 치료제로 적용하려는 질병들 중 하나이다. 대식세포들은 면 역체계를 조절함으로 항상성에 역할을 수행하며 염증성 환경을 조성하는 M1과 항염증성 환경을 조성하는 M2 두가지 기능적 표현형을 나타낸다. 최근, 대 식세포의 자세한 메커니즘을 위하여 M2a, M2b, M2c, M2d로 나타나는 M2 아류형들의 중요도가 부각되고 있다. 최근 논문들에서 중간엽 줄기세포의 치료 효능과 이에 대한 메커니즘을 밝혀내기 위하여 노력하고 있지만, 여전히 이에 대한 이해도는 부족하다. 본 연구에서는 중간엽 줄기세포 유래 분비 인자의 치료 효능을 연구하였고 분비 인자들 중 면역 조절의 물질들을 발굴하며 이에 대한 메커니즘을 확인하였다. In vitro 실험들을 위하여 대식세포 세포주인, RAW264.7 세포와 복강 내 대식세포들을 LPS 자극의 유무 하에 지방 유래 중간엽 줄기세포 분비 인자로 처치하였다. 대식세포의 염증성 마커들과 항염증성 마커들을 유세포분석, qRT-PCR, 그리고 효소면역분석법으로 분석을 하였다. 중간엽 줄기세포 분비 인자들의 메커니즘을 밝혀내기 위하여 NF-κB/AKT and STAT/SOCS 신호 전달 경로를 웨스턴 블롯을 통하여 확인하였다. 중간엽 줄기세포 분비 인자의 치료 효능은 류마티스 관절염의 동물 모델인 콜라겐 유도성 관절염 동물과 전신홍반루푸스의 동물 모델인 NZB W/F1 마우스를 사용하여 확인하였다. 중간 엽 줄기세포 분비 인자는 LC/MS-MS 프로테오믹스와 DAVID bioinformatics를 통하여 분석하였다. 중화 항체와 재조합단백질을 사용하여 중간엽 줄기세 포 분비 인자 내의 주요 인자를 확인하였다. 중간엽 줄기세포 분비 인자는 대식세포의 iNOS와 TNF-α와 같은 염증성 마커들을 감소시키고 Arg-1과 IL-10과 같은 항염증성 마커들을 증가시켰다. 또한 중간엽 줄기세포 분비 인자는 대식세포의 PTEN의 발현을 증가시키고 NF-κB와 AKT의 인산화를 감소시켰으며 PTEN 억제재가 중간엽 줄기세포 분비 인자의 면역조절 효과를 감소시켰다. 중간엽 줄기세포 분비 인자에 의하여 SOCS1 과 SOCS3의 활성화 되었으며 STAT1의 인산화가 감소하고 STAT3의 인산화가 증가하였다. 중간엽 줄기세포 분비 인자는 CIA와 NZB/WF1 마우스의 질병 활성도를 감소시켰고 대식세포를 M2b/c-like 표현형으로 변화 시켰다. Proteomics 분석을 통하여 중간엽 줄기세포 분비인자들에서 84개의 단백체들을 확인하였고 그 중 7개의 후보 물질들(ANAX1, CFH, DKK3, LGALS3BP, PTX3, PROS1, and SERPINF1)을 선정하였다. 후보 물질들 중PTX3를 선정하여 추가로 실험을 진행하였다. PTX3의 중화 항체는 중간엽 줄 기세포 분비 인자의 기능을 약화시켰으며 재조합형 PTX3는 중간엽 줄기세포 분비 인자와 비슷한 효과를 나타냈다. 중간엽 줄기세포 분비 인자는 RAW264.7 세포와 류마티스 관절염과 정신 홍반루푸스의 동물모델에서 염증을 조절하였다. 또한, 중간엽 줄기세포 분비 인자는 복강 내 대식세포의 M2b/c 분극화에 관여하며 PTX3가 이 효과에 주요 물질임을 확인하였다.