Alleviation of doxorubicin-induced cardiotoxicity via inhibition of TBL1X cleavage

Abstract

독소루비신(Doxorubicin)은 항암치료에 널리 사용되는 안트라사이클린 (anthracycline) 계열의 약물로, 독소루비신 유발 심근독성(Doxorubicininduced cardiotoxicity; DICT)이라는 부작용을 가진다. 독소루비신 유발 심근독성의 병태생리학은 아직 완전히 밝혀지지 않았으며, 예방 또는 치료를 위한 효과적인 전략도 아직 개발되지 않았다. 본 연구에서는 독소루비신 유발 심근독성에 있어서 Transducin beta like 1-linked (TBL1X)의 새로운 역할을 규명하였다. TBL1X는 심장에서 높게 발현되며, nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells (NF-kB), 유전자 전사 조절 및 WNT 신호전달 경로에서의 역할이 연구되어 왔다. 본 연구에서는 확장성 심근병증(Dilated cardiomyopathy; DCM) 환자에서 TBL1X 단백질의 발현이 낮음을 확인하였으며, 이는 TBL1X의 단백질 절단에 의한 것임을 밝혔다. 먼저, 쥐(rat) 심근세포주 H9c2에 독소루비신을 처리 시 caspase-3가 활성화되었으며, 이는 TBL1X의 125, 136, 215번째 아스파르트산 (Aspartate; D) 부위를 인지하여 절단시켰다. 단백질 절단과 관련된 기전 연구를 위해 세 부위의 아스파르트산을 알라닌 (Alanine; A)으로 모두 치환하여 절단이 일어나지 않는 변이체인 un-cleavable TBL1X(TBL1Xuclv)를 제작하였다. 정상형 TBL1X와 다르게 절단된 TBL1X는 유비퀴틴 (Ubiquitin) 의존적 분해를 통해 불안정화되어 β-catenin과의 결합이 감소되었고 Axin2 및 Ccnd1 유전자의 프로모터 (promoter) 지역을 점유하지 못하여 WNT 신호전달 활성화가 감소되었다. 또한, 독소루비신에 의한 세포사멸사도 TBL1Xuclv 과발현 시 완화되었다. 동일한 결과가 사람 줄기세포 및 동물모델에서도 나타나는지 확인하기 위해 추가 연구를 진행하였다. 그 결과, 정상형 사람유도만능줄기세포 유래 심근세포(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes; hiPSCCMs)에 TBL1Xuclv를 과발현하면 세포사멸사가 완화되고 독소루비신에 의해 나타나는 박동 능력 감소, 전도율 지연 및 불규칙성 등의 전기생리학적 특성이 개선되는 것을 확인하였다. 마지막으로, 생쥐 (mouse) 심장 조직에서도 아데노연관바이러스 (Adeno-associated virus; AAV)를 이용하여 심장 특이적으로 과발현 시 정상형 대비 TBL1Xuclv에서 독소루비신에 의한 심근수축기능 저해와 콜라겐 축적을 개선시켜 심근독성을 감소시켰다. 결론적으로, 이러한 결과들은 독소루비신을 통해 TBL1X 단백질이 caspase- 3에 의존적으로 절단되고 이로 인해 WNT 신호전달이 억제되어 심근세포의 세포사멸사가 유도된다는 점을 시사한다. 또한, TBL1X 단백질의 새로운 역할을 규명하였고 환자의 암 치료 중 발생하는 독소루비신 유도 심근독성을 완화시킬 수 있어 효과적인 치료 전략을 구체화하는데 용이하게 할 것이다. Doxorubicin (DOX) is a widely used anthracycline anticancer agent. However, its irreversible effects on the heart can result in DOX-induced cardiotoxicity (DICT) postcancer treatment. The pathophysiology of DICT has not yet been fully elucidated, and there are no effective strategies for its prevention or treatment. This study explores the novel role of Transducin beta-like 1X-linked (TBL1X) in both the development and regulation of DICT. TBL1X exhibits high expression in the normal heart, and its roles in nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kB) signaling pathway, subunit in corepressor complex, and Wnt/β-catenin signaling pathway have been elucidated. In this study, a low expression of the TBL1X protein was observed in patients with dilated cardiomyopathy (DCM). Moreover, theses findings were attributed to the cleavage of TBL1X. In H9c2 cells, DOX treatment activated caspase-3 and -7, leading to significant cleavage of TBL1X. Inhibiting these caspases reduced TBL1X cleavage. Bioinformatics prediction analysis targeted Aspartate (D) residues at positions 125, 136, and 215, identified as sites for DOX-activated caspase-3-mediated cleavage. To identify the cleavage sites, Aspartate (D) residues were substituted with Alanine (A) using site-directed mutagenesis, resulting in the generation of un-cleavable TBL1X (TBL1Xuclv) where all three sites were replaced. Unlike the TBL1Xuclv, the cleaved form of wild-type TBL1X (TBL1XWT), through ubiquitin-dependent degradation, became destabilized, leading to reduced binding with β-catenin. Consequently, it failed to occupy the promoter regions of Axin2 and Ccnd1 genes, resulting in decreased activation of the WNT signaling pathway. Furthermore, the cell apoptotic signaling induced by DOX was also attenuated upon overexpressing of TBL1Xuclv. To ascertain if the same outcomes were observed in both human cardiac cells and animal models, additional investigations were conduted. The results revealed that overespression of TBL1Xuclv in normal human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) mitigated cellular apoptosis and improved the cardic functions, including diminished cardiac rhythmic function, delayed conduction, irregularities and abnormal calcium homeostasis induced by DOX. Also, utilizing adeno-associated virus (AAV) for cardiac-specific overexpression of TBL1Xuclv in mouse heart also ameliorated DOX induced cardiomyocyte contractile dysfunction and collagen accumulation, thereby reducing cardiotoxicity compared to the control group (TBL1XWT). In conclusion, these findings collectively demonstrate that caspase-3-mediated DOXdependent cleavage of TBL1X inhibits Wnt/β-catenin signaling, leading to cardiomyocyte apoptosis. Moreover, the novel role of TBL1X protein has been elucidated, providing insight into alleviating DICT during cancer treatment, thereby facilitating the development of effective therapeutic strategies.