mRNA stability and translational efficiency regulated by miRNA binding site in UTR

Abstract

Although mRNA vaccine technology is developing rapidly after Covid-19, problems such as low stability and intracellular delivery efficiency are still raised. miRNA is a single-stranded RNA molecule with a length of ~22 nucleotides(nt), which binds to the 5' and 3' untranslated regions of the target mRNA and acts as an important regulator to suppress the expression of the corresponding gene. Recently, there have been many studies on the regulation of viruses by miRNA, and studies have been reported that, unlike the existing miRNA interactions, miR-17 and let-7 directly bind to RNA viruses to rather stabilize RNA virus proliferation. In addition, the importance of the location of the miRNA binding site targeting the viral RNA was emphasized through studies that the secondary structure of the virus changes after miRNA binds to the viral RNA. Therefore, in this study, we developed a method to quantify the stability of mRNA and changed the binding energy of the site that can directly bind to miRNA, the presence or absence of 5'UTR, 5' capping structure, zipper structure, and hairpin structure. We tried to optimize the structure that can increase the stability and translation efficiency of let-7a mRNA vaccine. The result is as follows. 1) To check translation efficiency, a reporter assay system using luciferase was established. 2) When there was a miRNA binding site with high miRNA-mRNA binding energy in the 3' UTR site after luciferase, the translation efficiency of luciferase by let-7a was increased. 3) The translation efficiency of let-7a was higher than that of BVDV and CHIKV viral RNAs having let-7f binding sites used as controls. 4) The higher the miRNA-mRNA binding energy, the smaller the decrease in translation efficiency with time, and the higher the translation efficiency after 48 hours. On the other hand, when miRNA-mRNA was combined as a seed match, translation efficiency was rather reduced. 5) In the presence of a let-7a binding site in the 5' UTR region, the translation efficiency was lower than in the presence of a binding site in the 3'UTR, but the translation efficiency was highest when both the 5'UTR and 3'UTR regions were present. . 6) The 5' capping structure increased translation efficiency, and the higher the binding energy in the zipper structure, the higher the stability of luciferase mRNA. 7) Hairpin structure was not effective in increasing translation efficiency. From the above results, it was confirmed that the translation efficiency of luciferase was increased when miRNA binding site with high binding energy to let-7a was added to the 5'UTR and 3'UTR regions. Based on this, if a construct that increases the stability of mRNA is developed, it is thought that it will contribute to research on new mRNA vaccines with improved stability Covid-19 이후 mRNA 백신 기술은 급격히 발전하고 있지만, 아직 낮은 안정성과 세포 내로의 전달 효율 등의 문제점이 제기되고 있다. miRNA는 ~22 nucleotide(nt)의 길이를 갖는 단일 가닥 RNA 분자로서, 표적 mRNA의 5’, 3’ 비번역부위에 결합하여 해당 유전자의 발현을 억제하는 중요한 조절자 역할을 한다. 최근 miRNA에 의한 바이러스의 조절에 관한 많은 연구가 있으며, 기존의 miRNA 상호작용과는 달리 miR-17 및 let-7가 RNA 바이러스에 직접 결합하여 RNA 바이러스 증식을 오히려 안정화시킨다는 연구가 보고되었다. 또한 miRNA가 바이러스 RNA에 결합한 후, 바이러스의 2차 구조가 변화한다는 연구 등을 통해 바이러스 RNA를 표적으로 하는 miRNA 결합 부위 위치의 중요성이 강조되었다. 따라서 본 연구에서는 mRNA의 안정성을 정량화할 수 있는 방법을 개발하고, miRNA와 직접적으로 결합할 수 있는 부위 (miRNA binding site, MBS)의 결합에너지, 5’UTR의 유무, 5’ -Capping 구조, Zipper 구조 및 hairpin 구조 등을 변화시켜, let-7a에 의한 mRNA 백신의 안정성과 번역효율성을 증가시킬 수 있는 구조를 최적화하고자 하였다. 결과는 다음과 같다. 1) 번역효율성 확인을 위해 luciferase를 이용한 reporter assay system을 확보하였다. 2) Luciferase 뒤인 3’ UTR 부위에 miRNA-mRNA 결합에너지가 높은 miRNA 결합부위가 있을 때, let-7a에 의한 luciferase의 번역효율성이 증가하였다. 3) 대조군으로 사용된 let-7f의 결합부위를 지닌 BVDV, CHIKV 바이러스 RNA 보다 let-7a의 번역효율성이 높았다. 4) miRNA-mRNA 결합에너지가 높을수록 시간에 따른 번역효율성의 감소폭이 적어지며, 48시간 후의 번역효율성이 높아진다. 반면, miRNA-mRNA 가 seed match로 결합 시에는 오히려 변역효율성이 감소되었다. 5) 5’ UTR 부위에 let-7a 결합부위가 존재시, 3’UTR에 결합부위가 있을 때보다 번역효율이 떨어지지만, 5’UTR 과 3’UTR 부위 양쪽에 존재 시에 번역 효율성이 가장 높았다. 6) 5’ Capping 구조는 변역효율성을 증가시키고, zipper 구조에서 결합에너지가 높을수록 luciferase mRNA의 안정성이 더 높았다. 7) Hairpin 구조는 번역효율성 증가에 효과적이지 않았다. 이상의 결과에서, let-7a와의 결합에너지가 높은 MBS를 5’UTR 및 3’ UTR 부위에 넣었을 때, luciferase의 번역 효율성이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 mRNA의 백신 안정성을 증가시키는 구조체가 개발된다면 안정성이 개선된 새로운 mRNA 백신 연구에 기여를 할 것이라 사료된다.