Lipid nanoparticle formulated protein transduction domain-bone morphogenetic protein-2 enhances wound healing in type 1 diabetic mice

Abstract

Decreased angiogenesis contributes to delayed wound healing in diabetic patients. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP2), which has been approved by the FDA for inducing bone regeneration, has also been shown to promote angiogenesis. However, the short half-lives of soluble growth factors such as rhBMP2 limit their use in wound-healing applications. To overcome this limitation, we propose a novel delivery model utilizing a protein transduction domain (PTD) formulated in lipid nanoparticle (LNP). We aim to determine whether a gelatin hydrogel dressing loaded with LNP formulated PTD-BMP2 (LNP-PTD-BMP2) can improve the angiogenic function of BMP2 and improve diabetic wound healing. In vitro, we found that compared to the control and rhBMP2, LNP-PTD-BMP2 induced higher tube formation of human umbilical vein endothelial cells and increased the cell recruitment capacity of HaCaT cells in a scratch wound assay. Large, full-thickness back skin wounds were inflicted on streptozotocin-induced diabetic mice. Gelatin hydrogel cross-linked by microbial transglutaminase containing rhBMP2, LNP-PTD-BMP2, or a control was applied to diabetic wounds. Wounds treated with LNP-PTD-BMP2 exhibited enhanced wound closure, increased re-epithelialization rates, and higher collagen deposition than the rhBMP2 or control treatments. In an immunofluorescence study, the LNP-PTD-BMP2 treatment showed more CD31- and α-SMA-positive cells, thus demonstrating a higher neovascularization capacity than rhBMP2 or control treatments. Additionally, in vivo near-infrared fluorescent images showed that LNP-PTD-BMP2 has a longer half-life than rhBMP2 and that BMP2 localizes around wounds. These findings suggest that LNP-PTD-BMP2-loaded gelatin hydrogel is a viable treatment for diabetic wounds. 혈관신생능의 저하는 당뇨환자의 상처치유지연에서 중요한 병인으로알려져 있다. 골형성 유도 물질로 FDA의 승인을 받은 재조합 골형성 단백질-2(rhBMP2)는 혈관신생에 작용하는 것으로 알려졌다. 그러나 rhBMP2는 짧은 반감기 등의 제한점으로 상처치유에 적용하는 데 어려움이 있다. rhBMP2와 같은 수용성 성장인자들의 제한점을 해결하기 위해서 LNP(지질나노입자, lipid nanoparticle) 제형화된 단백질 전달 영역(protein transduction domain, PTD)을 활용한 새로운 전달 모형이 활용됐다. 본 연구의 목적은 LNP 제형화된 PTD-BMP2 (LNP-PTD-BMP2)를 gelatin hydrogel(GH) 드레싱을 사용하여 당뇨병성 상처에 적용하였을 때 LNP-PTD-BMP2가 성공적으로 세포내로 transduction할 수 있는지 여부와 BMP2의 혈관신생 기능이 당뇨병성 상처치유를 향상시키는지를 확인하는 것이다. In vitro에서 시행한 혈관신생연구에서 LNP-PTD-BMP2는 인간제대정맥내피세포(HUVEC)의 더 높은 튜브 형성을 유도하였고, scratch wound assay에서 LNP-PTD-BMP2는 대조군, rhBMP2보다 인간각질형성세포(HaCaT)의 더 많은 세포 모집 능력(cell recruitment capacity)을 유도했다. In vivo에서 streptozotocin으로 유도한 당뇨쥐의 등에 전층피부상처를 낸 후 microbial transglutaminase로 crosslink한 GH에 대조군, rhBMP2, LNP-PTD-BMP2를 각각 넣어 적용하였다. LNP-PTD-BMP2로 처치한 상처에서 유의하게 빠른 상처치유율 및 재상피화율과 유의하게 높은 collagen 침착이 관찰되었다. 면역형광염색분석에서 LNP-PTD-BMP2로 처치한 상처에서 CD31과 α-SMA 양성 세포 수가 유의하게 증가하여 신생혈관형성능력이 향상된 것을 확인하였다. 또한, in vivo 근적외선형광영상분석에서는 LNP-PTD-BMP2가 rhBMP2보다 반감기가 더 길고 BMP2 방출 영역이 상처 주위에 국한됨을 확인하였다. LNP-PTD-BMP2는 당뇨상처에 성공적으로 transduction되었고 혈관신생 및 상처치유를 향상시켰다. 본 결과들을 종합할 때, LNP-PTD-BMP2는 당뇨병성 상처치료에 잠재적인 치료제로 생각한다.