Effects of S100A8/S100A9 (calprotectin) on human respiratory mucosal epithelium and its regulatory mechanism

Abstract

Inflammation is a host's defense mechanism against external stimulants, and the immune response by the first frontline barrier epithelium and inflammatory cells is complexly generated. Chronic rhinosinusitis (CRS) is a chronic inflammatory disease that occurs in the paranasal sinuses. A number of substances are involved in the immune response of CRS, and various pathophysiological mechanisms have been suggested. In particular, calprotectin as a damage-associated molecular pattern is a heterodimer complex of S100A8 and S100A9 and performs various functions in epithelial and inflammatory cells. In addition, although S100A8 and S100A9 are known to have strong pro-inflammatory effects, studies on their effects on the human nasal epithelial (HNE) cells and pathogenesis of CRS are rare. Therefore, this study aimed to investigate the effects of S100A8, S100A9, and calprotectin on human nasal epithelium, CRS, and regulatory mechanisms. Chapter I explores the conditions under which S100A8 and S100A9 are elevated in the upper airway nasal epithelium and investigates the roles of S100A8 and S100A9 in HNE cells. S100A8 and S100A9 increased when pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α and IL-1β, were treated. They were inhibited by anti-inflammatory cytokines, such as IL-4 and IL-13. In addition, they were overexpressed in the squamous epithelium, not in normal tissues, through immunohistochemical findings of CRS tissues. In order to check whether S100A8 and S100A9 affect squamous metaplasia, recombinant S100A8, S100A9, and calprotectin were applied to HNE cells. Matrix metalloproteinase 9 (MMP9), a marker for tissue remodeling, and Involucrin, a marker for squamous metaplasia, were then used to confirm the optimal experimental conditions. Furthermore, the effects of S100A8, S100A9, and calprotectin on HNE cells were investigated through bulk RNA sequencing analysis. It was particularly confirmed that S100A9 induces squamous metaplasia by being involved in retinoic acid metabolism, which is important for HNE cells differentiation. In Chapter II, the role of calprotectin, known as an antimicrobial peptide, on eosinophils and eosinophil extracellular traps (EETs) in the pathophysiology of CRS is investigated. Previously, calprotectin was known to be predominantly expressed in neutrophils and be mainly involved in neutrophil extracellular traps (NETs). However, CRS with nasal polyps (CRSwNP) insufficiently explained the presence of only calprotectin and neutrophil because eosinophils were known to be important type 2 inflammation cells in disease development. Therefore, the purpose of this study was to investigate the relationship between calprotectin and eosinophil and between calprotectin and EETs. To prove this hypothesis, using eosinophilic CRS mouse and human tissues, major basic protein (MPB) and myeloperoxidase (MPO), which are markers specific to eosinophils and neutrophils, respectively, were subjected to simultaneous immunofluorescence with calprotectin. As a result, calprotectin-positive cells were co-localized with MBP-positive cells, and calprotectin was involved in EETs as well as NETs. In addition, calprotectin-positive cells in the tissue showed a positive correlation with tissue and blood eosinophils. Additionally, calprotectin showed a correlation with olfactory dysfunction, with the Lund-Mackay CT score indicating the severity of CRS and the use of JECREC scores. Through this, it was demonstrated that the expression of calprotectin in CRS tissue can be a biomarker indicating disease severity. Summarizing these two studies, increased S100A8 and S1000A9 due to inflammation in HNE cells induces tissue remodeling, such as squamous metaplasia through the modulation of retinoic acid metabolism. In addition, calprotectin is secreted by neutrophils and eosinophils and has an important role in the innate immune response of CRSwNP, owing to its involvement in EETs. In conclusion, S100A8, S100A9, and calprotectin expressed in epithelial and inflammatory cells reflect the disease severity of patients with CRS. 염증은 외부 자극에 대한 숙주의 방어 기제로 상기도의 첫 번째 장벽인 비강 점막 상피세포와 점막 하층에 분포하는 염증세포에 의한 복합적인 면역반응으로 인해 발생한다. 비강과 부비동에 발생하는 염증성 질환인 만성 비부비동염은 점막 상피세포와 다수의 염증 관련 단백질, 그리고 다양한 면역세포가 관여하고 있으며 이들과 관련한 다양한 병태생리학적 면역 기전이 제시되어 있다. 특히, S100A8과 S100A9의 이종이량체 복합체인 calprotectin (칼프로텍틴)은 손상 관련 분자 패턴으로써 비강 점막 상피 세포와 염증 세포에서 다양한 기능을 수행하며 S100A8과 S100A9는 강력한 전염증 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 이 단백질들이 비강 점막 상피세포에 미치는 영향과 만성 비부비동염의 발병 기전에 대한 연구는 아직까지 드물다. 따라서 본 연구에서는 S100A8, S100A9 및 칼프로텍틴이 비강 점막 상피세포와 비강의 염증성 질환인 만성 비부비동염에 미치는 영향과 조절 기전을 조사하였다. 1장에서는 S100A8과 S100A9이 비강 점막 상피세포에서 증가되는 조건과 그 역할을 조사하였다. S100A8과 S100A9는 비강 점막 상피세포에서 TNF-α 및 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인을 처리했을 때 증가했고, IL-4 및 IL-13과 같은 항염증성 사이토카인에 의해 억제되었다. 또한, 만성 비부비동염 환자의 조직을 가지고 면역조직화학염색을 시행하고 분석하였다. 그 결과는 S100A8과 S100A9이 정상 상피층이 아닌 편평 상피층에서 과발현되었다. 이를 통해 S100A8과 S100A9이 비강 점막 상피세포의 편평 상피 화생에 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 진행하였다. 배양된 비강 점막 상피세포에 재조합 S100A8, S100A9, 칼프로텍틴을 각각 처리한 후 조직 리모델링 표지자인 MMP9와 편평 상피 화생의 표지자인 Involucrin의 발현을 확인하였다. S100A8과 S100A9이 편평 상피 화생에 영향을 주는 최적의 실험 조건을 확인하였고 bulk RNA 시퀀싱 분석을 통해 S100A8, S100A9, 칼프로텍틴이 비강 점막 상피세포에 미치는 영향을 확인하였다. 이 실험을 통해 S100A8과 S100A9, 그리고 칼프로텍틴이 비강 점막 상피세포에 미치는 공통점과 차이점을 확인할 수 있었다. 특히, S100A9는 비강 점막 상피세포 분화에 중요한 레티노산 대사에 관여한다는 것을 확인하였고, 편평 상피 화생과 조직 리모델링에 관련이 있는 것을 확인하였다. 2장에서는 만성 비부비동염의 병태생리학에서 중요한 염증세포로 알려진 호산구와 그와 관련한 호산구 세포외 트랩에 대하여 항균 펩타이드로 알려진 칼프로텍틴의 관련성을 조사하였다. 기존의 문헌들에 따르면 칼프로텍틴은 주로 호중구에서 발현되며, 선천적 염증 반응에 중요한 호중구 세포외 트랩에 관여하는 것으로 알려져 있었다. 하지만 비용종을 동반한 만성 비부비동염은 호산구가 질병 발달에 중요한 제2형 염증 질환으로 알려져 있어 칼프로텍틴과 호중구만을 설명하기에는 불충분하였다. 따라서 본 연구의 목적은 호산구에서 칼프로텍틴의 발현을 확인하고 칼프로텍틴과 호산구 세포외 트랩의 관계를 조사하였다. 이 가설을 증명하기 위해 호산구성 만성 비부비동염 마우스 모델과 만성 비부비동염 환자의 조직을 사용하여 각각 호산구 및 호중구에 특이적인 표지자인 major basic protein (MBP)와 myeloperoxidase (MPO), 그리고 칼프로텍틴 항체를 가지고 동시에 삼중 면역 형광 염색을 진행하였다. 칼프로텍틴 양성 세포는 MPO 양성 세포와 일치할 뿐만 아니라 MBP에 양성을 나타내는 세포도 일치하는 소견을 보였다. 이를 통해 칼프로텍틴이 호중구와 호산구에서 각각 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 칼프로텍틴은 호중구 세포외 트랩뿐만 아니라 호산구 세포외 트랩에서도 발현되는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 조직 내 칼프로텍틴 양성 세포가 많을 수록 조직 및 혈액의 호산구가 비례하게 증가하는 임상적인 의미를 발견할 수 있었다. 뿐만 아니라 칼프로텍틴을 발현하는 염증세포는 후각장애, 만성 비부비동염의 중증도를 나타내는 Lund-Mackay CT 점수, JECREC 점수와 상관관계를 보였다. 결국, 이 연구를 통해 만성 비부비동염의 조직에서 칼프로텍틴의 발현이 만성 비부비동염의 중증도를 나타내는 바이오마커가 될 수 있음을 입증하였다. 이 두 연구를 요약하면, 비강 점막 상피세포에서 염증에 의해 증가된 S100A8과 S1000A9는 레티노이드 대사의 조절에 관여하고 편평 상피 화생과 같은 조직 리모델링을 유도하였다. 또한, 이들의 복합체인 칼프로텍틴은 항균 펩타이드로써 호중구와 호산구에서 각각 분비되며 호산구 세포외 트랩에서도 관여하기 때문에 비용종을 동반한 만성 비부비동염의 선천 면역 반응에 중요한 역할을 하였다. 결론적으로 본 연구를 통해 비강 상피 점막세포와 염증세포에서 발현되는 S100A8, S100A9, 칼프로텍틴은 만성 비부비동염 환자의 질병 중증도를 반영하는 중요한 생체 지표가 될 수 있음을 확인하였다.