Nupr1 role in adipogenesis

Abstract

선진국의 비만율 증가는 제 2 형 당뇨병, 심혈관 질환 등과 같은 대사 질환의 발생 증가와 상관관계가 있기 때문에 심각한 문제로 대두되고 있다. 지방세포분화 조절 메커니즘은 비만과 같은 신진대사 질환과의 상관관계 때문에 널리 연구되는 주제이다. 그러므로, 지방세포분화를 조절하는 생물학적 네트워크를 연구하는 것은 비만의 병리생리학에 대한 더 큰 이해를 가져올 수 있다. 지방세포 분화는 초기 지방 분화와 후기 지방 분화과정을 거친다. 초기 지방분화에서 지방세포의 유사 분열이 일어나고 C/EBPβ는 DNA 결합 활성을 얻는다. 활성화된 C/EBPβ는 지방 분화의 결정적 역할을 하는 C/EBP와 PPAR을 활성화하고, 증가된 C/EBP와 PPAR에 의해 유사 분열을 멈추게 한 후, 후기 지방 분화 단계가 시작된다. 결과적으로, 후기 지방 분화 동안, 지방세포는 인슐린 민감도를 얻고, 지방세포는 확대되는 지질 방울을 얻으며, 지방 생성 효소와 지방산 결합 효소 발현을 증가시킨다. 마지막으로, 지방세포는 성숙해지고 에너지 저장고로서의 기능을 수행할 수 있게 된다. 이번 연구에서 Nupr1 이 백색 지방 조직에 존재하고 지방 분화 동안 Nupr1 의 발현이 변화하는 것을 확인했다. Nupr1 은 증가된 소포체 스트레스로부터 세포를 보호하는 것으로 알려진 8kd 의 핵 및 세포질 스트레스 활성화 단백질이다. Nupr1 은 DNA 복구, 세포 조절, 세포 사멸, 세포 이동 및 침윤을 조절한다고 알려져 있다. 또한, Nupr1 발현은 산화환원 항상성, 페롭토시스, 에너지 대사를 조절하여 미토콘드리아를 보호하고 정상기능을 유지시키는 단백질로 알려져 있다. Nupr1 은 암에서 광범위하게 연구되어 왔지만, 신진대사와 지방 분화에 있어서 Nupr1 의 역할은 알려져 있지 않아 연구가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 마우스 3T3-L1 지방선구세포를 성숙한 지방세포로의 분화를 유도하고 지방분화과정 중 Nupr1 발현과 역할을 확인하였다. Nupr1 은 지방 분화 Day 0 에 발현되고, 지방 분화의 Day 3 일에서 Day 8 일째인 말기에 증가된 수준으로 발현된다는 것을 확인했다. 또한, 3T3-L1 세포에서 siRNA 를 통해 Nupr1 발현이 억제시키면, 지방분화 생성이 억제되는 것을 확인했다. Nupr1 발현이 억제되면 초기 지방형성 Day0 에 CHOP 의 발현이 증가되는데, 이는 C/EBP 활성 억제 및 그에 따른 유사분열의 억제로 인해 지방세포분화 손상의 원인이 될 수 있음을 보여줍니다. 또한, 지방 세포 분화 과정에서 Nupr1 은 후기에도 발현이 되는데, 이는 Nupr1 이 후기 지방 생성 동안 역할을 할 가능성이 있다. 지방 분화 후기에 Nupr1 의 억제제인 ZZW-115 를 처리하여 지방 생성이 잘 이루어지지 않으며 세포사멸이 일어나는 것을 확인했다. proapoptotic 유전자인 BAX 와 PUMA 는 ZZW-115 처리된 세포에서 autophagy 표적 유전자 LC3b 와 함께 그 수준을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 같은 방식으로 처리된 세포에서 미토콘드리아 융합 관련 유전자 opa1 및 MFN2 의 하향 조절에 의해 융합과 관련하여 미토콘드리아 분열이 증가하는 것으로 나타났다. 추가 데이터는 ZZW-115 처리된 세포의 미토콘드리아가 대조군과 관련하여 초과산화물 존재를 증가시켰고 산소 소비율이 대조군 샘플보다 상대적으로 낮아 Nupr1 이 고갈될 때 미토콘드리아의 기능장애를 나타내는 것을 보여줍니다. 3T3-L1 세포의 분화유도 2일 후 siRNA를 통해 Nupr1 을 녹다운 시킨 경우에도 유사한 결과가 확인되었다. 이러한 결과는 Nupr1 의 스트레스 보호 기능을 통해 지방 분화 및 지방생성의 정상적인 발생을 유지시킨 다는 것을 예측할 수 있다. 본 연구결과를 통해, Nupr1 이 지방 생성의 정상적인 발생을 보호하고 허용하는 역할을 할 수 있으며 결과적으로 이 단백질이 비만 치료의 가능한 표적이 될 수 있음을 확인했다.

The increase of obesity rate in developed countries has been shown to be a serious problem, due to its correlation with the increase of incidence of other metabolic diseases, such as diabetes type 2, and cardiovascular diseases. Recently, adipogenesis is a topic that became widely researched due to its correlation with metabolic diseases, such as Obesity. Thus, studying the biological networks controlling adipogenesis may facilitate a greater understanding of the pathophysiology of obesity. Adipogenesis is characterized by early and late adipogenesis. In early adipogenesis mitotic clonal expansion happens. Whereas preadipocyte cells undergo mitosis, and C/EBPβ gains DNA binding activity. C/EBPβ, consequently, activates C/EBPα and PPARγ the main drivers of adipogenesis, which stops mitotic clonal expansion, due to their antimitotic nature, and the late differentiation phase starts. Consequently, during late adipogenesis, adipocytes gain insulin sensitivity, adipocyte cells gain lipid droplets that enlarge, and lipogenic enzymes and fatty acid-binding enzymes levels increase. Finally, adipocytes become mature and capable of performing their function as an energy reservoir. This study data shows that Nupr1 is in fact present in the white adipose tissue and changes its expression levels during adipogenesis. Nupr1 is a ubiquitous nuclear and cytoplasmic stress-activated protein, with an 8kda, known to protect cells from elevated ER stress. Nupr1’s function lays in DNA repair, cell regulation, apoptosis, cell migration, and invasion. In addition, Nupr1 expression is essential for mitochondria protection and normal function by controlling redox homeostasis, ferroptosis, and energy metabolism1. Nupr1 has been extensively studied in cancer, however, its role in metabolism and adipogenesis still has to be greatly explored. Therefore, in this study, I induced differentiation of mouse 3T3-L1 preadipocytes into mature adipocytes and verified Nupr1 expression and activity during adipogenesis. I demonstrate that Nupr1 is expressed on day 0 and, is expressed in increased levels in the late stages, days 3 to 8 of adipogenic differentiation. In addition, when Nupr1 is knocked down, via siRNA, in 3T3-L1 cells, adipogenesis is shown to be impaired. This study also demonstrates that together with Nupr1 depletion, CHOP increases its levels at day 0 of early adipogenesis, which might constitute a cause for the adipogenesis impairment seen before, due to C/EBPβ activity inhibition. In the same way, after treatment of 3T3-L1 cells with the Nupr1 inhibitor, ZZW-115, during late adipogenesis, cells showed to become impaired and, cell death was also verified. ZZW-115 treated cells showed to have mitochondria superoxide increased presence in relation to the control, and it was correlated with apoptosis, evidenced by proapoptotic BAX and PUMA increased expression in these cells. This happening was accompanied by mitochondrial fragmentation. Similar results were verified when Nupr1 was knocked down via siNupr1 2 days after induction of differentiation of 3T3-L1 cells. Moreover, this study demonstrates that with the depletion of Nupr1, ROS production increases, followed by an increase in mitochondrial fragmentation, impairment, and ultimately cell death. Taken together, my study demonstrates that Nupr1 might have a role in protecting 3T3-L1 cells from CHOP in early adipogenesis and ROS excessive production in late adipogenesis. Consequently, permitting normal occurrence of adipogenesis. Therefore, this protein might constitute a possible target for the treatment of Obesity.