Inhibition of oxidative stress-induced cardiomyocyte apoptosis by regulating hexokinase 2-targeting miRNA

Abstract

Hexokinase 2 (HK2) is a metabolic sensor that couples glycolysis and oxidative phosphorylation of mitochondria by binding to the outer mitochondrial membrane (OMM), and it also has been implicated in induction of apoptotic process by regulating the integrity of OMM. When HK2 detaches from the mitochondria, it triggers permeability increase of the OMM and subsequently facilitates the cytosolic release of cytochrome c, a major apoptosis-inducing factor. According to previous studies, a harsh microenvironment created by ischemic heart disease such as low tissue oxygen and nutrients, and increased reactive oxygen species (ROS) can cause cardiomyocyte apoptosis. Under these conditions, the expression of HK2 in heart significantly decrease and such down-regulation of HK2 was correlated to the increased apoptosis of cardiomyocytes. Therefore, prevention of HK2 down-regulation may salvage cardiomyocytes from apoptosis. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that either inhibit transcription of target mRNAs or degrade the targeted mRNAs via complementary binding to the 3’UTR (untranslated region) of the targeted mRNAs. Since miRNAs are known to be involved in virtually every biological processes, it is reasonable to assume that the expression of HK2 is also regulated by miRNAs. Currently, to my best knowledge, there is no previous study examined the miRNA-mediated regulation of HK2 in cardiomyocytes. Thus, in the present study, miRNA-mediated modulation of HK2 during ROS 2(H2O2)-induced cardiomyocyte apoptosis was investigated. First, the expression of HK2 in cardiomyocytes exposed to H2O2 was evaluated. H2O2 (500μM) induced cardiomyocyte apoptosis and it also decreased the mitochondrial expression of HK2. Based on miRNA-target prediction databases and empirical data, miR-181a was identified as a HK2-targeting miRNA and its expression increased in cardiovascular disease such as myocardial infraction and ischemia/reperfusion injury. To further examine the effect of negative regulation of the selected HK2-targeting miRNA on cardiomyocyte apoptosis, anti-miR-181a, which neutralizes endogenous miR-181a, was utilized. Delivery of anti-miR-181a significantly abrogated the H2O2-induced suppression of HK2 expression and subsequent disruption of mitochondrial membrane potential, improving the survival of cardiomyocytes exposed to H2O2. These findings suggest that H2O2-induced increase of miR-181a and subsequent down regulation of HK2 contributes to the apoptosis of cardiomyocytes exposed to ROS. Neutralizing miR-181a can be a viable and effective means to prevent cardiomyocyte from apoptosis in ischemic heart disease.

헥소 키나아제 2 (Hexokinase 2, HK2)는 미토콘드리아의 외막에 주로 존재하는 효소로, 생체 내에서 당질분해와 미토콘드리아에서의 산화적 인산화 과정을 연계해주는 역할을 하나 미토콘드리아 외막의 안정성을 조절함으로써 세포사멸의 과정에도 참여하는 것으로 알려져 있다. HK2가 미토콘드리아로부터 분리되면 미토콘드리아 외막의 투과도를 증가시켜 세포사멸을 유발하는 사이토크롬 C의 세포질로의 유출을 유발한다. 기존의 연구에 따르면 허혈성 심장질환에서 심근세포의 사멸을 일으키는 활성화산소종이 증가하며 이러한 조건하에서 심장의 HK2 발현이 현저히 감소함이 보고된 바 있다. 따라서 HK2의 발현 저하를 억제함으로써 심근세포를 사멸로부터 보호할 수 있을 것으로 예상된다. 마이크로 RNA는 단백질 전사로 이어지지 않는 짧은 길이의 RNA로 생체 내에서 표적 하는 메신저 RNA에 상보적으로 결합하여 해당 메신저 RNA의 전사를 방해하는 억제제로 작용한다. 이들 마이크로 RNA는 생체 내 거의 모든 과정에 관여하는 것으로 알려져 있어 산화스트레스 하에서 HK2의 발현과정에도 관여할 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서는 활성화산소종 중 하나인 과산화수소에 의한 심근세포의 사멸과정에서 마이크로 RNA에 의해 매개되는 HK2의 발현기전을 알아보았다. 과산화수소수 (500M)에 의해 심근세포의 사멸이 일어나는 것을 확인하였으며 이때 미토콘드리아의 HK2의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 마이크로 RNA와 해당 표적을 예측하는 데이터베이스 검색 및 실험을 통해 miR-181 이 HK2를 표적하며 이 마이크로 RNA의 발현이 심근경색 동물모델 및 허혈/재관류 손상 동물모델에서 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 miR-181의 영향을 상쇄하기 위해 anti-miR-181의 전달을 통해 miR-181을 중화시킨 경우 과산화수소에 의한 HK2의 발현저하는 물론 뒤이은 미토콘드리아 막전위의 소실이 회복되어 결과적으로 과산화수소에 노출된 심근세포의 생존을 개선시켰다. 이러한 anti-miR-181의 전달은 허혈/재관류 동물모델에서 심근손상 진행에 따른 심장섬유화를 개선시키는 효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 과산화수소에 의해 증가된 miR-181과 그에 따른 HK2의 발현억제가 활성화산소종에 노출된 심근세포의 사멸에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.