Evaluation of DNA damage repair gene alterations, microsatellite instability status, and tumor mutational burden as predictive factors of olaparib sensitivity in gastric cancer

Abstract

암의 많은 원인 중 하나인 DNA 손상 복구 경로의 기능 장애이다. 돌연변이, 메틸화 또는 기타 이유로 인해 상동성 재조합 기능에 결핍이 있는 암은 PARP 억제제의 감수성과 유전체 불안정성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 또한, DNA 손상 복구 경로에 결핍이 있는 암 역시 비슷한 특징을 갖는 것으로 보고되고 있다. 게다가, 일부 연구에서는 현미부수체 불안정성이 높거나 종양 변이부담이 높은 암과 같이 돌연변이가 많은 암의 경우 DNA 손상 복구 경로 기능에 결핍이 있을 확률이 높다. 그럼에도 불구하고 많은 연구가 여전히 olaparib 감수성 예측 인자로서 주요 상동성 재조합 기능 관련 유전자 돌연변이에만 초점을 맞추고 있다. 본 연구는 주요 상동성 재조합 기능 관련 유전자뿐만 아니라 DNA 손상 복구 경로 관련 유전자 돌연변이 및 유전체 불안정성 예측 인자와 49개 위암 세포주에서 olaparib 감수성과의 연관성을 확인한다. Olaparib의 효능을 확인하기 위해 세포주를 olaparib으로 5일간 처리한 후 CCK-8 분석을 수행하였다. IC50은 CalcuSyn 소프트웨어를 통해 계산되었으며, 세포주는 IC50이 10μM 미만이며 10μM에서 억제율이 50% 이상일 때 olaparib에 민감하다고 분류된다. 그런 다음, 표적 시퀀싱을 이용하여 49개의 DNA 손상 복구 경로 관련 유전자, 현미부수체 불안정성 상태 및 종양 변이부담을 확인했다. BRCA1, RAD51C 및 MLH1 메틸화는 bisulfite 시퀀싱에 의해 확인했다. 그 결과, 20개의 세포주에서 16개의 DNA 손상 복구 경로 관련 유전자에서 돌연변이가 있음을 확인했다. 전체 세포주 중 12 개의 세포주는 olaparib에 감수성이 높았고, DNA 손상 복구 경로 유전자의 변이군은 olaparib에 더 민감했다 (p = 0.034). 구체적으로 상동성 재조합 기능과 DNA 불일치 복구 기능에변이가 있는 세포주는 야생군에 비해 olaparib에 민감했다 (p = 0.005, p = 0.018). 흥미롭게도 비상동말단연결 기능 유전자에 변이는 olaparib 민감성에 큰 영향을 미치지 않았다. 종양변이부담은 세포주 (범위 = 1.45 ~ 61.03, 중앙값 = 8.70)에 분포되어 있다. 흥미롭게도, olaparib 감수성 그룹은 저항성 그룹보다 TMB가 더 높았다 (중앙값 = 15.3 대 10.9, p <0.0001). 4 개의 세포주 (SNU-1, SNU-638, IM95m, NUGC-3)는 현미부수체 불안정성을 보였으며 모두 MLH1 단백질 발현이 없었다. 현미부수체 불안정성 세포주는 다른 세포주보다 상당히 높은 종양 변이부담을 가졌다 (중앙값 : 47.96 대 8.72, p <0.0001). 3 개의 현미부수체 불안정성 세포주는 olaparib에 민감하였으나 현미부수체 불안정성 세포주 중 종양 변이부담이 가장 낮은 NUGC-3 (29.07)은 내성이 있었다. 각 요인의 중요성과 올라 파립 감수성 예측 능력을 분석 한 결과, 주요 상동성 재조합 기능 및 비상동말단연결을 제외한 DNA 손상 복구 경로 변이가 비슷하게 중요했으며 (2.53 대 2.48), 비상동말단연결을 제외한 DNA 손상 복구 경로 변이가 olaparib 민감성을 가장 정확히 예측했다. 우리 연구는 olaparib 민감성을 예측하기 위해 주요 상동성 재조합 기능변이뿐만 아니라 나아가 DNA 손상 복구 경로 관연 유전자 변이 역시 확인해야한다고 제안한다.

One of the many factors that causes cancer is a dysfunction of the DNA damage response pathway (DDR). Cancers with homologous recombination (HR) deficiency due to mutation, methylation, or other reasons, are known to be increased the sensitivity of PARP inhibitors and genomic instability. Besides, DDR, like mismatch repair (MMR), deficiency cancers have been recently reported to have similar features. Furthermore, some studies suggested that many of hypermutated cancers, such as microsatellite instability-high (MSI-H) or high tumor mutational burden (TMB) are DDR deficient. Nevertheless, many studies still have focused on HR-related gene mutations as a predictor of olaparib. Here, we aim to determine whether the DDR gene alterations and genomic instability markers can predict olaparib efficacy in 49 gastric cancer cell lines. We profiled the genomic status of selected DDR genes, MSI status, and TMB using targeted sequencing. BRCA1, RAD51C, and MLH1 methylation were detected by bisulfite sequencing. We separated cell lines as an altered group when it had the truncated mutation, homozygous deletion, or methylation of more than 40% in those genes. RAD51C and MMR-related protein expression was determined by western blot. Then, to determine the efficacy of olaparib, cells were treated with olaparib for 5 days and assessed using CCK-8 assay. Cell lines were classified as a sensitive group when it had less than 10 µM of IC50 and more than 50% of inhibition rate at 10µM. As a result, twenty of 49 cell lines had the alteration in one or more of the 16 DDR-related genes. In our cell line panel, twelve cell lines were sensitive to olaparib, and DDR without NHEJ altered group was more sensitive to olaparib than the wild type group (p = 0.004). In detail, cell lines with alterations in the HR and MMR subpathways were significantly sensitive among the subtype of DDR pathways respectively, p = 0.005 and p = 0.018. TMB level was widely distributed among the GC cell lines (range = 1.45 to 61.03, median = 8.70), and the DDR altered without NHEJ group had higher TMB than wild type group (p = 0.021). Four cell lines (SNU-1, SNU-638, IM95m, and NUGC-3) were MSI-H, and all of them were no MLH1 protein expression. MSI-H cell lines had significantly higher TMB than other cell lines (median : 47.96 vs 8.72, p < 0.0001). Three MSI-H cell lines were sensitive to olaparib, but NUGC-3 with the lowest TMB (29.07mt/mb) among MSI-H cell lines was resistant. As a result of analyzing the importance and olaparib sensitivity predictive ability of each factor, core HR alteration and DDR alteration excluding NHEJ were similarly important (2.53 vs 2.48), and the area under the curve (AUC) was the largest for DDR alteration excluding NHEJ. In our result, the olaparib sensitive group had the alteration in DDR genes and high TMB. MSI-H cell lines were sensitive to olaparib when it had high TMB. When we analyzed single factors and combined scores, the predictive ability of olaparib sensitivity was better with DDR alteration excluding NHEJ. For accurate predictions that are sensitive to olaparib, our data suggest that it is necessary to analysis DDR alteration by extending core HR alteration.