Development and Application of Cell-based Assay for LRP4 Antibody Associated with Myasthenia Gravis

Abstract

배경: 중증근무력증은 골격근의 근력약화를 특징으로 하는 신경근접합부의 자가항체 매개 자가면역질환이다. 중증근무력증 환자의 약 90%는 아세틸콜린수용체(AChR) 또는 근육-특이키나아제(MuSK)에 대한 자가항체를 지니고 있다. 아세틸콜린수용체항체(AChR-Ab) 또는 MuSK 항체(MuSK-Ab)가 검출되지 않는 MG 환자들에서 저밀도지단백수용체관련단백질 4(LRP4)에 대한 자가항체(LRP4-Ab)가 최근에 확인되었다. 이 연구의 목적은 중증근무력증과 연관되어 있는 LRP4-Ab 를 검출하기 위한 세포기반분석법(CBA)을 개발하고 이 세포기반분석법에 중증근무력증 환자의 샘플들을 적용하여 LRP4- Ab 를 분석하는 것이다. 방법: CBA 의 개발을 위해 LRP4 cDNA 가 삽입된 pCMV6-AV-GFP 벡터를 이용하였다. 클로닝 된 LRP4 플라스미드를 인간배아신장293(HEK293)세포에 형질감염(transfection)을 시켰고, LRP4 mRNA 와 단백질의 발현을 확인하고자 역전사중합효소연쇄반응(RTPCR)과 웨스턴블랏을 이용하였다. 형질감염시킨 HEK293 세포를 Rabbit anti-human LRP4 항체 및 Alexa Fluor 594 와 접합된 Goat anti- rabbit와 함께 반응을 시켰다. 면역형광염색은 형광현미경을 사용하여 평가하였다. CBA 확립 후, MG 환자 201 명, MG 이외의 다른 신경근질환 환자 38 명, 그리고 건강한 대조군 12 명으로부터 얻은 혈청 샘플을 LRP4-Ab 에 대한 CBA 에 적용하였다. LRP4-Ab 의 존재는 형광 강도 및 형광 현미경에서 이들의 co-localization 을 기반으로 결정하였다. 결과: LRP4 가 형질주입된 HEK293 세포에서 LRP4 mRNA 와 단백질의 발현을 각각 RT-PCR 과 웨스턴블랏으로 확인하였다. 형광현미경에서 LRP4 가 형질감염된 세포의 세포 표면을 따라 녹색 형광이 관찰되었고, 세포막에서 LRP 의 발현을 확인하였다. 항LRP4 항체를 첨가한 후, LRP4 형질주입된 HEK293 세포막에서 녹색 형광과 적색 형광이 확인되으며, 이 두 형광이 발현된 위치는 서로 일치하였다. 이렇게 개발된 세포기반분석법을 이용하여 총 201명의 MG 환자 중 2 명(1%)에서 LRP4-Ab 가 검출되었다. 이들 2 명의 MG 환자는 모두 안구 증상만 있었고, AChR-Ab 는 음성이었으며 아세틸콜린에스트라제 억제제와 프레드니솔론 치료에 반응을 보였다. 결론: 이 연구를 통하여 MG 와 관련된 LRP4-Ab 검출을 위한 CBA 가 개발하였고, CBA 를 이용하여 MG 환자의 혈청에서 LRP4-Abs 를 확인하였다. 이 연구를 통하여 개발된 CBA 를 이용하여 MG 환자들에서 LRP4-Ab 를 검출할 수 있고 따라서 희귀질환인 MG 의 진단에 도움이 될 것으로 기대된다.

Background: Myasthenia gravis (MG) is an autoantibody mediated autoimmune disorder of the neuromuscular junction characterized by fatigable muscle weakness. Approximately 90% of patients with MG have autoantibodies against the acetylcholine receptor (AChR) or muscle-specific kinase (MuSK). Among about 10% of MG patients who do not have detectable AChR-Ab or MuSK-Ab (double seronegative), autoantibodies against the low-density lipoprotein receptor-related protein 4 (LRP4-Ab) have been detected recently. The purpose of this study is to develop an in-house cell-based assay (CBA) to detect LRP4-Ab and to apply the CBA for detecting LRP4-Ab in the samples from MG patients. Method: For the development of CBA, LRP4 complementary DNA (cDNA) was amplified and cloned into the pCMV6-AC-GFP vector. The cloned LRP4 plasmids were transfected into human embryonic kidney 293 (HEK293) cells. The reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and western blotting were performed to confirm the expression of LRP4 mRNA and protein, respectively. The transfected HEK293 cells were incubated with rabbit anti human LRP4 antibody and goat ant-rabbit IgG conjugated with Alexa Fluor 594. The immunofluorescence staining was evaluated using a fluorescence microscope. After the establishment of CBA, totals of 251 serum samples collected from 201 patients with MG, 38 with other neuromuscular diseases, and 12 healthy controls were applied to the CBA for LRP4-Ab. The presence of LRP4-Abs was determined based on the fluorescence intensity and their localization in fluorescence microscopy. Results: The expression of LRP4 mRNA and protein in the LRP4 transfected HEK293 cells was confirmed by RT-PCR and western blotting, respectively. In fluorescence microscopy, green fluorescence was observed along the cell surface of the LRP4 transfected cells, indicating the expression of LRP4 on the cell membranes. After adding the LRP4-Ab, the cell membranes were stained with red fluorescence that was colocalized with the green fluorescence. Two of 201 MG patients including 52 double seronegative MG patients were positive for LRP4-Ab. The two MG patients had only ocular symptoms and did not have AChR-Ab and MuSK-Ab. They were responsive to the treatment with acetylcholinesterase inhibitor and prednisolone. Conclusion: CBA for detection of LRP4-Ab associated with myasthenia gravis was developed. Using CBA, LRP4-Abs were found in the serum from MG patients.