Oxidative stress by mitochondrial dysfunction contributes to the activation of necroptosis in acute respiratory distress syndrome

Abstract

Background: Acute respiratory distress syndrome (ARDS) develops due to acute injury to the lungs caused by pulmonary or extrapulmonary abnormalities. Since the pathogenesis of ARDS is complex, the mechanisms of development of ARDS are not fully understood. Necroptosis is linked to cell death in ARDS. Oxidative stress has also been implicated in the pathogenesis of ARDS. Although the effect of necroptosis through oxidative stress is identified in the cellular system, the mechanisms for the activation of necroptosis in ARDS remain unclear. Purpose: This study aims to confirm whether oxidative stress contributes to the receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3)-mediated necroptosis associated with ARDS. Methods: The lung tissues from seven human subjects with ARDS were investigated for the involvement of RIPK3-mediated necroptosis and oxidative stress using immunoblot and immunostaining. We also investigated whether the oxidative stress due to mitochondrial dysfunction might exacerbate the RIPK3-mediated necroptosis in the lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) mouse model. Results We found that RIPK3- mediated necroptosis was significantly elevated in patients with ARDS compared to the non-ARDS subjects. Oxidative stress was increased in patients with ARDS due to the accumulation of 4-HNE, a marker for oxidative stress. Both RIPK3-mediated necroptosis and oxidative stress were elevated in the lung epithelial cells of the patients with ARDS. The oxidative stress due to mitochondrial dysfunction caused by oligomycin, an inhibitor of ATP synthase, significantly increased lung injury in the LPS-induced ALI mouse model compared to the ALI model without oligomycin treatment. Moreover, the oxidative stress due to mitochondrial dysfunction significantly increased the levels of RIPK3 and the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs) by necroptosis in the lung during ALI compared to the group administered the dose without treatment of oligomycin. Conclusion: The results of the human ARDS analysis showed that RIPK3-mediated necroptosis and oxidative stress were increased in ARDS, and the LPS lung injury mouse model with oxidative stress induced by mitochondrial dysfunction had increased RIPK3-mediated necroptosis, lung injury, and DAMPs release. Our results suggest that oxidative stress due to mitochondrial dysfunction might contribute to a critical mechanism for RIPK3-mediated necroptosis-induced lung injury during ARDS.

배경: 급성호흡곤란증후군은 폐 또는 폐 이외의 문제로 유발되는 폐의 급성 손상으로 발생한다. 급성호흡곤란증후군의 발병 기전은 복잡하며, 아직 모든 발병 기전이 밝혀지지는 않았다. 산화스트레스 (oxidative stress)와 세포사멸 종류 중 necroptosis는 급성호흡곤란 발생에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 이전에 보고된 세포실험 연구에서 산화스트레스가 necroptosis의 유도에 관여됨이 확인 되었다. 그러나 생체 내 (In Vivo)에서는 그 관련성이 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다. 목적: 본 연구에서는 급성호흡곤란증후군 환자의 폐에서 산화 스트레스와 RIPK3-mediated necroptosis가 발생함을 확인하고, lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 급성 폐손상 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능장애로 유발된 산화스트레스가 RIPK3-mediated necroptosis에 영향을 주는지 밝히고자 하였다. 방법: 7명의 급성호흡곤란증후군 환자의 폐 조직병리 슬라이드에서 면역 염색을 시행하였고, 2명의 급성호흡곤란 증후군 환자의 폐 조직에서 단백질 면역 블랏을 시행하였다. 동물 실험에서 급성 폐손상 마우스 모델은 LPS를 기도내 주입하여 만들었다. 산화스트레스는 미토콘드리아 기능장애를 유발하는 oligomycin을 마우스 복강내 주입하여 발생시켰다. 급성 폐손상 마우스 모델에서 산화스트레스가 유도된 그룹과 유도되지 않은 그룹의 폐 손상 정도를 조직병리 염색을 이용하여 비교하였다. 그리고 RIPK3-mediated necroptosis 발생 정도를 단백질 면역 블랏과 면역화학 염색을 이용하여 비교하였다. 마우스의 기관지 세척으로 획득한 기관지 폐포세척액에서 necroptosis와 관련되어 분비되는 damage- associated molecular patterns (DAMPs)의 양을 비교하였다. 결과: 본 실험에서 사용된 급성호흡곤란증후군 환자의 폐 조직은 급성호흡곤란증후군이 없는 폐 조직에 비해 RIPK3-mediated necroptosis와 산화스트레스가 증가하였다. 그리고 RIPK3-mediated necroptosis 및 산화스트레스 모두 급성호흡곤란증후군 환자의 폐 상피세포에서 증가하였다. ATP synthase를 억제하는 oligomcyin을 투여하여 산화스트레스가 유도된 폐손상 마우스 모델에서 폐 손상 정도와 폐 조직의 RIPK3-mediated necroptosis의 발생이 oligomycin을 사용하지 않은 폐손상 마우스 모델에 비해 증가되었다. 그리고 oligomycin으로 산화스트레스가 유발된 폐손상 마우스 모델의 기관지 폐포 세척액에서 necroptosis로 인한 DAMPs 분비가 oligomycin을 사용하지 않은 폐손상 마우스 모델에 비해 증가하였다. 결론: 급성호흡곤란 증후군 환자의 폐 조직에서 RIPK3-meidated necroptosis와 산화스트레스가 증가하였다. 그리고 LPS로 유도된 급성 폐손상 마우스 모델에서 산화스트레스가 증가하면 폐손상 및 RIPK3-mediated necroptosis와 DAMPs 분비가 증가하였다. 이상의 결과들은 급성호흡곤란 증후군의 발생 과정에서 산화스트레스의 증가가 RIPK3-medicatied necroptosis의 활성화에 기여할 수 있음을 시사한다.