Ultrastructural and immunophenotypical changes of the glomerular filtration barrier in early stage of IgA nephropathy

Abstract

배경: IgA 신증은 전세계적으로 가장 흔한 원발성 사구체신염의 하나로, 주로 IgA 면역글로불린이 사구체의 메산지움에 침착되는 병이다. 임상증상은 무증상 미세혈뇨부터 심한 단백뇨까지 다양하게 관찰될 수 있으며, 이러한 배뇨증상은 사구체 여과장벽의 손상에 기인하는 것으로 잘 알려져 있다. IgA 신증 환자의 30% 정도는 말기 신부전으로 진행될 수 있기에 환자의 정확한 등급을 확인하고 예후를 예측하는 것은 환자의 치료에 중요한 역할을 한다. 현재 임상경과 및 병리조직 결과와 예후의 관련성에 대한 연구는 주로 광학현미경을 이용하고 있다. 하지만 광학현미경을 통해 조직학적 변화가 관찰되지 않는 초기 IgA신증 환자를 대상으로 전자현미경 및 면역조직화학검사를 통해 사구체 여과장벽의 초미세구조 및 면역형질의 변화를 확인하고자 하였다. 재료 및 방법: 2007년부터 2012년까지 본원에서 IgA신증으로 진단받은 환자분 중에서 Haas subclass I and Oxford classification (M0E0S0T0C0)에 해당하는 31명의 환자를 대상으로 하였으며 동일 시기에 본원에서 시행된 정상공여자의 이식 신 생검 중에서 특이적인 현미경적 소견이 관찰되지 않는 20명의 대조군을 선택하였다. 대조군의 제약으로 성별과 나이는 환자군과 비매칭으로 진행되었다. 전자현미경 검색은 사구체 여과장벽을 이루는 세가지 구성물을 정량적 검색과 정성적 검색으로 나누어 진행하였으며 연구의 정확도를 증가시키기 위하여 측정 및 계산에 컴퓨터를 기반으로 한 자동화된 프로그램을 사용하였다. 면역조직화학염색 검사는 사구체 여과장벽의 구성중 배뇨증상과 가장 연관성이 높을 것으로 판단되는 족세포와 관련된 항체인 CD10, WT1, nephrin, synaptopodin과 족세포 손상을 억제하는 Sirt6유전자의 전사인자중 하나인 Runt-related transcription factor 2 (RUNX2), 그리고 일시적 수용체 전위차 통로중의 하나인 transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8)을 사용하였다. 결과: 31명의 환자군 중 단백뇨는 11례(35%), 혈뇨는 29례(93%)에서 관찰되었다. 광학현미경상 IgA환자군은 사구체의 뚜렷한 변화가 없음에도 경도의 신세뇨관의 위축 (17례, 54.8%, p < 0.001), 경도의 신 간질 경화증 (10례, 32.2%, p = 0.013), 그리고 경도의 간질 내 염증세포 침윤 (7례, 22.6%, p = 0.061)이 관찰 되었다. 사구체 여과장벽의 정량적 전자현미경 분석 결과, 족세포의 발돌기 너비 (foot process width, FPW)는 대조군(312.29 ± 77.33nm) 보다 증가(479.17 ± 60.72nm)되었으며 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p <0.001). 또한 사구체 기저막 길이 대비 손실된 족세포 돌기의 길이 비율(effaced foot process ratio, EFR)은 정상군(11.68 ± 4.31)보다 늘어났으며(89.15 ± 5.24) 통계적 유의한 차이를 보였다(p <0.001). 본 연구에서는 기존 연구에서 제시되었던 앞의 두 가지 인자보다 더 쉽고 편리하게 족세포 돌기 손상을 측정 및 확인할 수 있는 새로운 인자, “Effaced FP/ TPP”를 제안하였다. 이는 정상 족세포 돌기 숫자 대비 손실된 족세포 돌기의 숫자를 이용한 비율이며, 이 값 또한 환자군(88.72 ± 10.94)에서 정상군(22.95 ± 8.17)보다 늘어났으며 통계적 유의한 차이를 보였다(p < 0.001). 그리고 여과틈새의 세극막의 보존율(SD/FS)은 환자군(31.48 ± 13.36)이 정상군(55.51 ± 11.5)보다 낮게 관찰되었다(p < 0.001). 사구체 여과장벽의 두께 측정은 잘 알려진 산술 평균과 조화평균, 두 가지 방법을 사용하였으며, 두 가지 값 모두 환자군(산술:288.18 ± 62.12nm, 조화: 304.47 ± 65.93 nm)이 정상군(산술: 312.75 ± 60.82 nm, 조화: 331.69 ± 65.39 nm)보다 얇게 나왔으나 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다(산술: p = 0.1699, 조화: p = 0.1556). “Effaced FP/ TPP”를 제외한 정량적인 인자들은 모두 단백뇨 및 혈뇨의 유무에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았으나 이는 매우 초기 단계의 환자군이라는 제한점이 존재 하기 때문에 발견된 것으로 판단된다 (단백뇨: p = 0.0019, 혈뇨: p = 0.0012). 정성적 전자 현미경 결과 환자군과 대조군 간의 통계적인 유의한 차이를 보이는 인자로는 족세포 발돌기의 공포성 변화 (31례, p < 0.001), 사구체 기저막의 분열 (25례, p < 0.001) 및 불규칙한 변화 (17례, p < 0.001), 내피세포의 회랑 형성 (22례, p < 0.001) 및 내피세포하 확장 (30례, p < 0.001) 이 있었다. 그리고 메산지움의 전자 고밀도 침착물 뿐 아니라 6례는 상피하 또는 내피하 전자 고밀도 침착물을 관찰할 수 있었다. 면역염색조직화학검사를 통한 사구체 여과장벽은 주로 족세포에 집중된 항체를 사용하였으며, 그 결과 정상군 대비 환자군에서 통계적으로 유의한 CD10의 발현 감소, WT1의 거친 과립형 발현을 확인하였다. 또한 nephrin과 synaptopodin의 발현도 정상군에 비해 환자군에서 통계적으로 의미있게 발현이 감소하였다. 또한 환자군에서 RUNX2의 발현 이 통계적으로 유의하게 감소된 것을 확인하였으나, TRPM8의 발현 감소는 통계적으로 유의성이 없었다. 결론: 초기 IgA신증 환자를 대상으로 사구체 여과장벽의 초미세구조 및 표현형 변화를 확인하기 위하여 전자현미경 및 면역조직화학검사를 진행하였다. 그 결과, 광학현미경상 사구체여과장벽의 손상이 관찰되지 않은 초기의 IgA 신증 환자군에서 족세포와 사구체 기저막 뿐 만 아니라 내피세포의 변화가 관찰되었다. 이중에서 족세포의 정량적 및 정성적인 변화가 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 미루어 볼 때 족세포의 변화가 가장 먼저 시작되는 것으로 추측할 수 있다. 이러한 결과는 병태생리학적 측면뿐 아니라 임상적으로도 중요한 연구결과로 판단되며 앞으로 더 많은 IgA 신증 환자를 대상으로 한 연구가 필요 할 것으로 판단된다.

IgA nephropathy (IgAN) is a common glomerular disease characterized by immune complex deposits containing IgA as the major immunoglobulin which are located primarily in the glomerular mesangium in most cases. IgAN exhibits urinary symptoms ranging from asymptomatic microscopic hematuria to nephrotic range proteinuria, which are related to damages of the glomerular filtration barrier (GFB) including podocytes, glomerular basement membrane (GBM) and endothelial cells. Although alterations on the GFB have been reported previously, most of the studies have been focused on only one cell type or single structure, which limit a comprehensive understanding among components of GFB. Therefore, I aimed to reveal ultrastructural and immunophenotypical changes of the components of GFB in early IgAN. Thirty-one cases of IgAN diagnosed as Haas subclass I and having scores of ‘M0 E0 S0 T0 C0’ according to Oxford classification and 20 healthy donors were the subject of the study. Ultrastructural changes of the podocytes and GBM were measured using an automated software program. Immunohistochemical stainings against CD10, WT1, nephrin, synaptopodin, RUNX2, TRPM8 were used as markers for podocyte injury. Electron microscopic examinations for GFB have conducted both quantitative and qualitative analysis which were showed statistically significant differences, respectively. First, the foot process width (FPW) of podocyte was significantly increased (479.17 ± 60.72 nm) over the control (312.29 ± 77.33 nm), (p < 0.001). In addition, the effaced foot process ratio (EFR) which is the ratio of the effaced foot processes (FP) to the total GBM length was greater (89.15 ± 5.24) than that of the normal group (11.68 ± 4.31) and statistically significant (p < 0.001). “Effaced FP/TPP”, which is the ratio of the number of effaced FP to normal FP, was also increased in the IgAN group (88.72 ± 10.94) compared to the normal (22.95 ± 8.17) and statistically significant (p < 0.001). The ratio of the slit diaphragms to filtration slits, “SD/FS”, was lower in the IgAN group (31.48 ± 13.36) than the normal (55.51 ± 11.5), (p < 0.001). Both arithmetic (288.18 ± 62.12 nm versus 312.75 ± 60.82 nm) and harmonic (304.47 ± 65.93 nm versus 331.69 ± 65.39 nm) means of GBM thickness were thinner in the IgAN group than the normal, however, did not show a statistical significance. FPW, EFR, SD/FS and TGBM were not correlated with the presence of proteinuria (p = 0.0019) and hematuria (p = 0.0012). Effaced FP/TPP was correlated with the presence of proteinuria and hematuria. Second, the qualitative evaluations for GFB components were evaluated: moderate to severe vacuolar changes of podocytes (93.55 % versus 40 %, p < 0.001), GBM splitting (80.65 % versus 0 %, p < 0.001) and irregularity of GBM (54.84 % versus 0 %, p < 0.001), moderately to severely widening of the subendothelial space (80.64 % versus 0 %, p < 0.001), and moderate to severe endothelial arcades (32.25 % versus 0 %, p < 0.001). In addition to the mesangial deposits, electron dense deposits (EDD) were also present in the subepithelial and/or subendothelial areas in six cases of IgAN. Immunohistochemical stainings showed decreased expression of CD10, synaptopodin, nephrin, RUNX2 and TRPM8 in podocytes of the IgAN group compared to those of the control group. WT-1 staining was coarse and granular pattern in the IgAN group. Even in the early stage of IgAN, the quantitative and qualitative ultrastructural changes of GFB and immunophenotypical alterations of podocytes were observed through no light microscopic changes were noted. A complex interplay among the components of GFB might play a role in urinary abnormalities of IgAN.