Overexpressed p32 localized in the endoplasmic reticulum and mitochondria contributes to the negative regulation of Ca2+-dependent endothelial nitric oxide synthase activity

Abstract

The p32 protein plays a crucial role in the regulation of cytosolic [Ca2+] ([Ca2+]c) that contributes to the Ca2+-dependent signaling cascade. Using an adenovirus and plasmid p32-overexpression system, we investigated the target organelles to determine if p32 was involved in the regulation of [Ca2+] that may be associated with Ca2+-dependent endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activation in endothelial cells. Using electron and confocal microscopic analyses, overexpressed p32 was localized to mitochondria and the endoplasmic reticulum, and played an important role in Ca2+ translocation that resulted in increased [Ca2+] in these organelles and reduced [Ca2+]c. This decreased [Ca2+]c by p32 overexpression attenuated the Ca2+-dependent signaling cascade of CaMKII/AKT/eNOS phosphorylation. In aortic endothelia of wild-type mice intravenously administered adenovirus encoding the p32 gene, increased p32 levels reduced NO production and accelerated reactive oxygen species (ROS) generation. In vascular tension assay, p32 overexpression decreased acetylcholine (Ach)-induced vasorelaxation and augmented phenylephrine (PE)-dependent vasoconstriction. Notably, decreased levels of arginase II protein using siArgII was associated with downregulation of overexpressed p32 protein, which contributed to CaMKII-dependent eNOS phosphorylation at Ser1177. These results indicated that increased protein levels of p32 caused endothelial dysfunction through attenuation of the Ca2+-dependent signaling cascade, and arginase II protein participated in the stability of p32. Therefore, p32 may be a novel target to treat vascular diseases associated with endothelial disorders.

p32 단백질은 세포질 내의 칼슘을 조절하는 데 중요한 역할을 하며 이는 칼슘 의존 신호전달체계에 의한다. adenovirus와 plasmid p32 과발현 시스템을 이용하여, 우리는 p32가 칼슘 조절에 관여하는지 그에 따른 칼슘에 의한 내피세포 산화질소 합성 효소 와 연관이 되는지를 알아보았다. 전자현미경과 공초점 현미경을 사용하여 p32가 미토콘드리아와 소포체에 있고, 이들 기관으로 칼슘을 이동시켜 세포질 내의 칼슘 농도를 낮추는 것을 확인하였다. p32 과 발현으로 감소하는 세포질 내의 칼슘은 CaMKII/AKT/eNOS인산화 칼슘 의존 신호전달 체계 (Ca2+ dependent signaling cascade of CaMKII/AKT/eNOS phosphorylation)를 방해하 였다. adenovirus에 p32 유전자를 표현하도록 하여 혈관 내로 주입받은 쥐들의 대동맥 내피세포에서 p32가 증가하면 산화질소의 생성이 감소하고, 활성산소의 생성이 가속 화되었다. 혈관 장력 분석에서도 p32의 과발현은 아세틸콜린에 의한 혈관 이완을 감 소시키고, 페닐레프린에 의한 혈관수축을 강화하였다. 특히, arginase II 단백질을 siArgII에 의해 감소시켰을 때 과발현시킨 p32 단백질이 같이 감소하였고, 이는 CaMKII에 의한 산화질소 Ser1177 인산화에 영향을 미쳤다. 이런 결과들은 p32 단백질 이 증가하면 칼슘 의존 신호전달 체계가 방해받으면서 내피세포의 기능 저하가 오고, arginase II 단백질은 p32의 안정성과 연관이 있음을 보여준다. 따라서 p32는 내피세포 에 의한 혈관질환이 발생할 때 중요한 목표 단백질이 될 가능성이 있다.