Vessels encapsulating tumor clusters type hepatocellular carcinoma: a distinct subtype with aggressive behavior

Abstract

간세포암은 전 세계에서 암 사망의 주요한 원인이다. 최근 간세포암에서 vessels encapsulating tumor cluster (VETC)라는 특이한 혈관 모양이 종양의 급격한 전파와 높은 재발율과 연관됨이 보고된 바 있으며, 이것은 CD34 면역염색에서 종양 군집을 혈관 내피세포가 동그랗게 둘러싸는 형태로 확인할 수 있다. 본 연구에서, 우리는 VETC의 임상 병리학적 특징을 규명하고, 특히 종양 미세 환경적 특징을 알아보고자 하였다. 본 연구는 2006년부터 2012년까지 세브란스 병원에서 수술적으로 절제된 원발성 간암 (코호트 1, 322례)과 간외 전이성 간암 (코호트 2, 130례) 조직을 대상으로 시행하였다. 각 종양에서 임상 및 병리학적 변수들 검색하였으며, 특히 종양의 섬유성 기질과 염증 세포 침윤을 반정량적으로 평가하였다. 면역 염색은 각각의 표지자로서 다음의 항목에 대하여 조직미세배열을 이용하여 시행하였다: CD34 (종양 혈관), αSMA, FAP (종양 섬유모세포), CD163 (제2형 종양 연관 대식세포), Zebl, Snail, Ezrin, S100A4, E-cadherin (상피-간엽 이행), PD-L1 (종양 면역), CAIX(저산소), K19 (종양 줄기세포), p53, glutamine synthetase, β-catenin (분자 아형). VETC 값은 조직 미세 배열과 큰 조직 절편에서 양호한 일치율을 보였으며 (급내 상관계수=0.642), 관찰자간 재현성 또한 우수하였다 (코헨 카파계수=0.879). VETC 값은 불량한 무병 생존율 (HR: 1.04 [1.01-1.08]; p=0.006), 조기 재발율 (HR: 1.04 [1.01-1.08]; p=0.006), 전체 생존율 (HR: 1.06 [1.00-1.11]; p=0.041), 그리고 간외 전이 (HR: 1.06 [1.01-1.11]; p= 0.009)와 연관 있었다. K-adaptive partitioning algorithm을 통해 VETC (%)의 최적의 절사값을 구하여 VETC가 종양 면적의 55% 이상인 것을 VETC 아형으로 정의하였다. VETC 아형은 전체 증례 중 23.0% (74/322)이었으며, 높은 혈중 AFP (> 400 ng/ml)/PIVKA-II (> 300 mAU/mL) 농도, 종양 크기 5 cm 이상, 대혈관 침범, 나쁜 분화, 거대기둥 모양, 소혈관 침범, 다핵 종양세포과 연관이 있었다. 또한 VETC 아형은 조기 재발 (HR 1.91 [1.20-3.02]; p=0.006), 불량한 전체 생존율 (HR 2.84 [1.29-6.26]; p=0.010), 그리고 간외 전이 (HR 2.38 [1.21-4.64]; p=0.011)와 연관 있음이 다변량 분석에서 확인되었다. VETC 아형은 거대기둥형 간세포암과 분자적으로는 β-catenin/Wnt 활성화와 연관 있는 것으로 관찰되었다. 종양미세환경 측면에서, VETC아형은 상피-간엽 이행성이 낮고 섬유성 종양 기질 및 염증세포 침윤이 적고, PD-L1 발현이 낮고, 저산소성을 보였다. 반면 VETC가 아닌 간암 (non-VETC)의 종양미세환경은 다양한 소견을 보였으며, 섬유성 기질이 있는 경우 (117례), 섬유성 기질이 없는 경우 (131례)로 세분하였다. 이중 섬유성 종양 기질이 있는 non-VETC는 상피-간엽 이행적 특징과 K19 및 PD-L1 발현이 높고, 염증세포의 침윤이 풍부하였으며, 분자적으로는 p53(-), glutamine synthetase/β-catenin (-)이 많았다 (모두 p<0.05). 반면 섬유성 기질이 없는 non-VETC는 VETC 아형과 비교했을 때, K19과 PD-L1 발현 정도가 비슷하고 섬유성 기질이 있는 non-VETC에 비하여서는 p53 발현이 높았다 (모두 p<0.05). 생존 분석에서 VETC 환자군이 가장 불량한 예후를 보였고, 섬유성 기질이 없는 non-VETC 환자군이 최상의 예후를 보였으며, 섬유성 기질이 있는 non-VETC가 그 중간의 예후를 보였다. 간외로 전이된 간세포암은 원발성 간세포암에 비해 조직학적으로는 거대 기둥형이 더 많았고, 미세 환경적 측면에서는 저산소성, 상피-간엽 이행성, K19의 발현이 높았다 (모두 p<0.05). 간외로 전이된 간세포암을 상피-간엽 이행성 마커의 발현정도에 따라 나누면, 상피-간엽 이행성이 낮은 간외전이 그룹은 VETC와 연관이 있었고, 상피-간엽 이행성이 높은 간외 전이 그룹은 섬유성 종양기질이 풍부하고, K19 발현, 염증세포 침윤과 PD-L1 발현율이 높았다 (모두 p< 0.05). 간외 전이가 일어난 장기별 특성으로서 폐로 전이된 간암은 거대 기둥형 및 VETC 아형이 많았고, 림프절로 전이된 종양은 K19 및 상피-간엽 이행성 표지자의 발현이 높았다. 원발 간암과와 대응되는 간외 전이 간암의 비교에서, VETC를 포함하여 종양의 병리학적 특성은 대체로 유지되는 경향을 보였다. 본 연구는 VETC가 공격적인 생물학적 특성과 연관된 간세암종의 아형으로서 종양 미세환경적으로 상피-간엽 이행성이 낮고 섬유성 종양 기질 및 염증세포 침윤이 적고, PD-L1 발현이 낮고, 저산소성의 특성을 보였다. 또한 VETC 형태를 보이는 간외전이 간암에서는 상피-간엽 이행성이 낮으며, 폐로의 전이가 많은 특성을 보였다. 결론적으로 본 연구에서 VETC 아형은 불량한 예후 예측하며, 간암의 맞춤치료를 위한 표지자로서의 가능성을 제시하였다.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the leading causes of cancer death worldwide. The concept of tumor microenvironment (TME) has been established as an integrated and essential component of the cancer development and progression. Among the heterogeneous population comprising TME, endothelial cells in HCC are of particular interest because they are strikingly involved in the tumor growth and represent a potential therapeutic target (transarterial chemoembolization, drugs). Recently, Fang et al. reported a distinct pattern of HCC vascularization that predicted rapid tumor dissemination and high recurrence rates. This pattern is characterized by the presence of CD34+ vessels completely encapsulating tumor clusters (VETC). In this study, we tried to refine the clinico-pathological features of VETC phenotype, especially in terms of TME. This study was performed on surgically resected primary liver (cohort 1, n=322) and extrahepatic metastatic (cohort 2, n=130) HCC tissue samples, obtained from Severance Hospital (Seoul, Korea), from 2006 to 2012. The tissue microarray was constructed, of which 96 cases of cohort 1 were stained with CD34 in the whole sections. The full spectrum of clinical and pathological variables was collected and fibrous tumor stroma and immune cell infiltration was assessed in each tumor. The following immunostaining was performed: tumor vessel (CD34), cancer-associated fibroblast (αSMA, FAP), tumor-associated macrophage (CD163), epithelial-mesenchymal transition (EMT; Zebl, IL-6, Snail, Ezrin, S100A4, E-cadherin), tumor immunity (PD-L1), hypoxia (CAIX), stemness (K19), molecular phenotypic markers (p53, glutamine synthetase, and β-catenin). The VETC phenotype (defined as ≥ 55% tumor area by CD34 immunostaining) was easily reproducible and reliably detectable in whole sections and small-sized tissues of tissue microarray. VETC-HCCs represented 23.0% of the cases and was significantly associated with several clinical and pathological features such as high alpha-fetoprotein (AFP) and PIVKA-II level, tumor size greater than 5 cm, macrovascular invasion, poor differentiation, macrotrabecular pattern, frequent microvascular invasion, multinucleated cells (p<0.05 for all). VETC phenotype was associated with early recurrence (HR 1.91 [1.20-3.02]; p=0.006), shorter DFS (HR 1.55 [1.07-2.24]; p=0.233), OS (HR 2.84 [1.29-6.26]; p=0.010), and extrahepatic metastasis (HR 2.38 [1.21-4.64]; p=0.011), in multivariable analysis. This distinct vascular pattern was enriched in the macrotrabecular massive HCC subtype, which was seen in 10.6% of patients. The VETC pattern was found to be easily detectable and a powerful pathological finding affecting survival. In terms of TME, VETC-HCCs showed less immune cell infiltration, scarce fibrous stroma, less PD-L1 expression, and increased CAIX expression. As non-VETC type HCCs, which are 77.0% of HCCs, had heterogenous TME, we further divided into groups of VETC-HCCs (n=74), non-VETC-HCCs with (n=117) or without fibrous stroma (n=131). Non-VETC type HCCs with fibrous stroma showed higher frequency of EMT-high, K19 expression, rich immune cell infiltration, PD-L1 expression, and double negative phenotype, compared to other groups. Non-VETC type HCCs without fibrous stroma showed similar level of K19 expression, macrophage infiltration and PD-L1 expression compared to VETC type HCC and higher frequency of p53 phenotype than Non-VETC type HCCs with fibrous stroma. On survival analysis, overall, the patients with VETC-HCC had the worst outcome, patients with non-VETC-HCCs without fibrous tumor stroma had the best prognosis, patients with non-VETC-HCCs with fibrous tumor were in the middle. Extrahepatic metastatic HCCs demonstrated more MTM subtype with CAIX expression and EMT-high and K19-expressing TME, than intrahepatic primary HCCs. Extrahepatic metastatic HCCs with EMT-low group (74%) were associated with VETC type HCCs. Extrahepatic metastatic HCCs with EMT-high group (26%) were associated with abundant fibrous stroma, K19 expression, rich immune cell infiltration and high level of PD-L1 expression. The metastatic tumors in lungs are associated with MTM subtype with VETC type HCCs. The metastatic tumors in LNs are more likely to express stemness- and EMT- related markers and PD-L1. In analysis for matched pair of primary and metastasis, overall, various features of HCCs including VETC were conserved during metastasis. This study suggests that VETC phenotype is a distinct aggressive subtype with CAIX expression, EMT-low TME, and may predict response to immune checkpoint inhibitors.