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Pseudomonas aeruginosa DksA1, a major transcriptional regulator for virulence control

Other Titles
 녹농균의 주요 전사인자 DksA1과 화합물을 통한 DksA1 억제를 이용한 녹농균의 병원성 억제 
Authors
 민경배 
College
 College of Medicine (의과대학) 
Department
 Others (기타) 
Degree
박사
Issue Date
2021-02
Abstract
Pseudomonas aeruginosa is a gram negative and ubiquitous environmental bacterium capable of causing infection to human, animal and plant. P. aeruginosa has flexible and extensive metabolic capacity to adapt to diverse environment including various host. In addition to the metabolic capacity, due to large size genome, gene pool of P. aeruginosa commonly contains the highest proportion of regulatory genes and signal pathways able to utilize genetic events to support establishing their various phenotypes and pathogenesis. P. aeruginosa is known as opportunistic human pathogen with obtaining resistance to therapeutics and high frequency to causing nosocomial infection to immunocompromised individuals through various passage. Pathogenesis of P. aeruginosa for survival and colonization in host by phenotypic alterations is dependent on specific chemical cell to cell communication called quorum sensing (QS). The QS plays critical role for virulence factor production, motility, biofilm development and increasing survival fitness of bacterial community. Recent findings showed that various stress responses for stress factors, such as nutrient starvation, lead to increase virulence factor production via enhancing QS signaling pathways. Among the stress responses, stringent response (SR) is highly conserved in many bacteria and mediated by two main elements, (i) a nucleotide alarmone, guanosine tetra- and penta-phosphate ((p)ppGpp), and (ii) an RNA polymerase–binding protein, DksA, that regulates various phenotypes including bacterial virulence. P. aeruginosa possesses two genes, dksA1 and dksA2, that encode DksA proteins. It remains elusive, however, which of these two genes plays a more important role in SR regulation. RNASeq–based transcriptome profiles of ΔdksA1, ΔdksA2, and ΔdksA1ΔdksA2 mutants were compared to globally assess the effects of these gene deletions on transcript levels coupled with phenotypic analyses. The ΔdksA1 mutant exhibited substantial defects in a wide range of phenotypes, including QS, anaerobiosis, and motility, whereas the ΔdksA2 mutant exhibited no significant phenotypic changes, suggesting that the dksA2 gene may not have an essential function in P. aeruginosa under the conditions used here. Of note, the ΔdksA1 mutants displayed substantially increased transcription of genes involved in polyamine biosynthesis, and we also detected increased polyamine levels in these mutants. Since SAM is a shared precursor for the production of both QS autoinducers and polyamines, these findings suggest that DksA1 deficiency skews the flow of SAM toward polyamine production rather than to QS signaling. To utilize the characteristics of dksA1 mutant for controlling P. aeruginosa infection, we screened two compounds for inhibiting function of DksA1 from library consisted of 6,970 chemical compounds provided by Korea Chemical Bank. These two compounds, named as Dkstatin-1 and Dkstatin-2 respectively, were used in further examination of phenotypes of P. aeruginosa. Reduced formazan production and elevated expression of rRNA protein by addition of Dkstatins represented that both Dkstatin-1 and Dkstatin-2 are implicated to inhibition of DksA1 activity. They showed significantly reduced production of elastase and pyocyanin, and had no growth inhibition effect on P. aeruginosa. Along with the reduced virulence, Dkstatin-1/-2 led reduced C4-HSL production, and it implicates that balance of QS network was disrupted. Moreover, Dkstatin-2 resulted those reductions with increased growth of P. aeruginosa. However, addition of both Dkstatins to cells at stationary phase with high cell density showed minimum effects on the phenotypes mentioned above, which reveals that effects of both Dkstatin-1/-2 on P. aeruginosa were dependent on cell density and prevented DksA1 to bind RNA polymerase. Dkstatin compounds boosted susceptibility to aminoglycoside antibiotics of P. aeruginosa as well as loss of viability under amino acid starvation caused by serine hydroxamate. Overall, these results suggested that chemical compounds such as Dksatatin-1 and Dkstatin-2 inhibiting DksA1 activity are able to be potential non-antibiotic drug for controlling P. aeruginosa infection. Together, our results indicate that DksA1, but not DksA2, controls many important phenotypes in P. aeruginosa. Also, we conclude that DksA1 may represent a potential target whose inhibition may help manage recalcitrant of P. aeruginosa infection, and it also suggests that disruption of the stringent response may become an alternative approach to treat infection of P. aeruginosa. 녹농균은 그람음성의 인수공통 감염성 병원균으로, 인간에게 기회 감염성 세균으로 알려져 있고 면역력이 저하된 환자에게 치명적인 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 녹농균은 매우 큰 크기의 유전체를 가지고 있으며, 이에 따라 많은 수의 유전자들을 가짐으로써 폭 넓은 물질대사능과 많은 종류의 세포 내, 세포 외 신호전달 체계를 구축한다. 이와 같은 특성을 바탕으로 하여, 녹농균은 환경에 대한 높은 적응력을 가지며 또한 다양한 병원성 인자들을 생성한다. 녹농균의 병원성 인자 생성은 정족수 인식이라는 과정을 통해서 일어나며, 녹농균의 정족수 인식은 병원성 인자 생성 이외에도 운동성, 생물막 형성 등에도 관여한다. 최근 경향에 따르면 다양한 종류의 환경성 스트레스 요인에 대한 방어기전이 녹농균의 정족수 인식을 보다 더 활성화시키며, 이에 따라 병원성 인자의 생성이 촉진된다는 연구 결과가 보고 되고 있다. 녹농균의 다양한 환경성 스트레스 방어기전 중 Stringent response (SR) 이라는 기전은 대부분의 세균들이 공통적으로 보유하고 있는 스트레스 방어 기전 중 하나이며, 핵산 기반의 경고인자(alarmone)과 RNA 중합효소와 결합하는 DksA1 단백질에 의해 작동한다. 우리는 녹농균의 DksA 에 조절 받는 표현형에 대해 연구하였다. 이번 연구에서 녹농균이 가지고 있는 2 가지 종류의 dksA 유전자인 dksA1 과 dksA2 중에서 dksA1 유전자가 녹농균의 표현형 발현에 주요한 역할을 하는 것을 전사체 분석과 표현형 분석을 통해 밝혀내었다. dksA1 돌연변이 균주는 정족수 인식능이 크게 저하되었으며 이에 따라 관련된 병원성 인자들의 생성이 모두 크게 저하 되는 것을 확인하였으며, 정족수 인식을 매개하는 신호 물질인 autoinducer 의 생성의 감소를 확인하였다. 또한, dksA1 돌연변이는 녹농균의 운동성, 혐기 호흡 및 생물막 구성분에 매우 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 따라서, 녹농균의 DksA1 단백질이 녹농균의 감염을 억제 또는 제어하기 위한 효과적인 약물 표적이 될 수 있을 것으로 판단하였다. DksA1 단백질은 자연적으로 변이가 되지 않으므로, DksA1 단백질의 활성을 저해하는 화합물을 선발하였다. 이를 위하여, 한국화합물은행에서 제공한 6970 개의 화합물로 구성된 화합물 라이브러리를 이용하여 DksA1 단백질 저해제를 탐색하였다. 고처리량 선별 방식을 도입하여 화합물을 선별 한 결과, 서로 다른 구조를 가진 2 종의 화합물을 선발 하였으며, 각각 Dkstatin-1 과 Dkstatin-2 으로 명명하였다. 이 두 화합물을 녹농균에 처리 한 결과, 녹농균의 병원성 인자 생성을 유의미하게 낮추었으며 신호 물질 autoinducer 생성이 감소되었다. 또한, 녹농균의 혐기 호흡능이 dksA1 돌연변이 균주와 비슷한 수준으로 감소하는 것을 확인하였으며 항생제에 대한 감수성 화합물 처리에 따라 증가 한 것을 확인 하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 이번 연구는 DksA1 을 억제하는 것이 항생제 사용을 줄이며, 효과적으로 녹농균의 감염을 억제 및 제어 할 수 있음을 시사한다.
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 3. Dissertation
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/185207
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