Base editor-directed high-throughput functional evaluation of human cancer-associated transition mutations

Abstract

Identifying causal driver mutations among the vast majority of other passenger mutations is key to understanding tumorigenesis and the development of cancer therapy. Here, we developed a novel high-throughput method using cytosine base editor (CBE) and adenine base editor (ABE) to evaluate the function of somatic cancer-associated mutations found in human cancer tissues. We designed a total of 83,731 and 23,613 sgRNAs for CBE and ABE, respectively, that would lead to the generation of 107,982 single nucleotide variants found in human somatic cancers. We performed screening to identify mutations with positive (outgrowing) or negative (depleting) effects on proliferation and survival followed by two sets of high-coverage small focused library evaluation with sgRNA libraries. We found that unique molecular identifier (UMI)-based analysis outperforms conventional one-sgRNA-one-mutation based analysis in identifying outgrowing or depleting mutations. Our screening platform using base editors should facilitate cancer genomics by identifying functional consequences of individual variants, which may contribute to the development of new therapeutic options.

종양 발생에 직접적으로 연관된 체세포 변이 (발암 변이, driver mutation)를 찾아내는 것은 종양발생의 과정을 이해하거나 치료제 개발에서 중요한 과제임. 본 연구에서는 크리스퍼 염기변환자와 고유 분자 표지자 (Unique molecular identifier, UMI)를 이용한 가이드 RNA 라이브러리를 이용하여 인간 종양에서 발견되는 점돌연변이변이를 유도하여 기능을 평가할 수 있는 새로운 대량산출 스크리닝 방법을 개발하였음. 본 연구에서는 83,731개의 C>T 혹은 G>A 변이와 23,613개의 A>G 혹은 T>C 변이 (Single nucleotide variants)를 유도할 수 있는 guide RNA (sgRNA) 라이브러리를 통해 107,952개의 인간 종양 단일염기변이를 유도하였음. 이를 이용한 실험과 이후 높은 coverage를 가지는 소규모의 라이브러리 실험을 통해 세포의 증식과 생존에 유리한 혹은 불리한 효과를 가지는 변이를 발굴하였음. 본 연구에서는 고유 분자 표지자를 이용한 본 방법이 기존의 변이 하나당 하나의 guide RNA를 사용하는 방식보다 변이를 발굴하는데 더 우수함을 보였음. 본 연구에서 제시한 스크리닝 방법은 단일 염기 수준의 종양 세포 변이의 기능변화를 구함으로써 종양 유전학에서 유용한 도구로 사용될 수 있으며, 이를 통해 종양에서의 새로운 치료 방법을 발굴할 수 있을 것으로 기대됨.