Mechanism of silver nanoparticle-induced neutrophil extracellular traps and its association with atherosclerosis

Abstract

Silver nanoparticles (AgNPs) are widely used in various fields because of their antimicrobial properties. However, many studies have reported that AgNPs can be harmful to both microorganisms and humans. Some nanoparticles, including AgNPs, stimulate the immune system and induce sterile inflammation. In case of AgNPs, reactive oxygen species (ROS) are a key factor of cytotoxicity in mammalian cells and an important factor in the immune reaction of neutrophils. Neutrophils are responsible for the first line of defense against infection. The immune reactions of neutrophils include the expulsion of webs of DNA surrounded by histones and granular proteins. These webs of DNA are termed neutrophil extracellular traps (NETs). NETs allow neutrophils to catch and destroy pathogens in extracellular spaces. However, excessive NET formation causes several autoimmune diseases such as gout, rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, and atherosclerosis. Atherosclerosis is a chronic inflammatory vascular disease characterized by the accumulation of lipids and local inflammation resulting in intimal lesion growth. Recent papers have suggested that NETs may be a cause of atherosclerosis. However, no study has yet reported a direct association between NETs and atherosclerosis. In this study, I investigated how AgNPs stimulate neutrophils, specifically focusing on NETs. Freshly isolated human neutrophils were treated with 5- or 100-nm AgNPs. The 5-nm AgNPs induced NET formation, but the 100-nm AgNPs did not. Subsequently, I investigated the mechanism of AgNP-induced NETs using known inhibitors related to NET formation. AgNP-induced NETs were dependent on ROS, peptidyl arginine deiminase, and neutrophil elastase. And AgNP-induced NETs were identified to comprise both nuclear and mitochondrial DNA. In an in vivo study, I addressed a realistic scenario of exposure to nanoparticles. An atherosclerosis-prone mouse model (ApoE-/- mice) was exposed to nanoparticles through the bloodstream or respiratory tract. To evaluate the progression of atherosclerosis, the total cholesterol, triglyceride, and glucose levels of the blood were measured, and lipid accumulation in the aorta was assessed using Oil Red O staining. The tail vein injection of AgNPs seemed to increase aortic lipid accumulation albeit with no statistical significance. However, the tail vein injection of AgNPs did not affect the total cholesterol, triglyceride, and glucose levels. Intratracheally instilled AgNPs did not induce lipid accumulation in the aorta or alter the total cholesterol, triglyceride, and glucose levels. Although in vivo data could not show solid evidences, in vitro results suggest a possibility that AgNP-induced NETs might exacerbate some inflammatory diseases such as atherosclerosis.

은나노입자는 고유의 항균작용 덕분에 식품의 보존, 화장품 등 살균 소독이 필요한 여러분야에서 사용되고 있다. 하지만 이러한 세균에 대한 독성은 미생물 뿐만 아니라 인체에도 해로울 수 있다. 은나노입자를 필두로 몇몇 금속 나노입자들은 면역 시스템을 자극하고 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 은나노입자는 활성산소 생성을 통한 세포독성을 일으키는데, 활성산소는 호중구의 면역반응을 일으키는 중요한 인자이기도하다. 호중구는 면역세포 중 가장 많은 수를 차지하고 있으며 감염에 대한 방어에 가장 빠르고 민감하게 반응하는 세포이다. 호중구세포외덫은 호중구의 면역반응 중 하나로 히스톤과 과립단백질이 붙어있는 자신의 DNA를 분출하여 병원균을 세포 밖에서 포획해 파괴할 수 있게 한다. 그러나 호중구세포외덫의 과도한 생산은 통풍, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 죽상동맥경화와 같은 자가면역 질환을 일으킬 수 있다. 죽상동맥경화는 혈관 내막에 지방 축적과 국지적 염증이 나타나고, 결국 죽상판이 형성되는 만성 염증성 혈관질환이다. 죽상판은 점점 성장하여 혈관을 얇아지게 하여 혈액순환 장애를 가져오고 결국 터지게 된다. 죽상판이 파열되면 혈전증이나 뇌졸중을 일으켜 죽음에까지 이를 수 있다. 최근 연구결과에 따르면 호중구세포외덫이 동맥경화를 일으킬 수 있다는 가능성이 제시되고 있지만 아직 그 연관성을 직접적으로 보여주는 연구는 발표되지 않고있다. 본 연구에서는 호중구가 은나노입자에 대해 어떻게 반응하는지, 특히 호중구세포외덫을 유도할 수 있는지를 연구하였다. 말초혈액에서 분리한 호중구에 5-nm 와 100-nm 은나노입자를 처리하고 호중구세포외덫을 확인하기 위해 double stranded DNA quantification assay를 시행하였다. 또한 DNA 특이적 염색제를 사용하여 육안으로도 확인하였다. 그 결과 5-nm 은나노입자에 의해서만 호중구세포외덫이 유도되었음을 확인하였다. 그 다음으로 활성산소, peptidyl arginine deiminase, neutrophil elastase 를 비롯한 호중구세포외덫 발생기전과 관련한 억제제를 사용하여 은나노입자에 의해 유도된 호중구세포외덫의 발생 기전이 고전적 경로에 의존함을 밝혔다. 추가적으로 은나노입자에 의해 유도된 호중구세포외덫의 DNA의 기원을 알아보기 위해 핵 및 미토콘드리아에 대한 유전자를 증폭시켜 확인한 결과 은나노입자에 의해 유도된 호중구세포외덫은 세포의 핵과 미토콘드리아의 핵 모두에서 유래된 것임을 확인하였다. 동물실험에서는 동맥경화 인자를 가지고 있는 마우스에 정맥으로 직접 주사 되는 상황과 호흡기를 통한 나노입자노출 상황을 가정하여 실험하였다. ApoE-/- 마우스에 동맥경화 식이를 함과 동시에 5-nm 은나노입자를 꼬리 정맥 또는 경기관지로 투여하였다. 혈액내 콜레스테롤, 글루코스 분석과 Oil Red O 염색을 통한 동맥 내의 지질침착정도를 분석하여 질병의 진행 정도를 판단하였다. 그 결과 꼬리정맥으로 투여된 은나노입자는 혈액내 콜레스테롤 함량 및 글루코스 농도를 변화 시키지는 못했지만 혈관의 지질 침착을 증가시키는 경향을 보였다. 기관지로 투여된 은나노입자는 혈액내 콜레스테롤 함량과 글루코스 농도, 혈관의 지질 침착 정도를 변화시키지 못하였다. 본 연구에서 비록 마우스 모델을 이용한 실험에서 의미 있는 결과를 얻을 수는 없었지만, 시험관 내 실험 결과는 은나노에 의해 유도된 호중구세포외덫이 동맥경화와 같은 염증 질환을 악화시킬 수 있다는 가능성을 제시하였다.