All-trans retinoic acid synergizes with enasidenib to differentiate IDH2-mutant acute myeloid leukemia cells

Abstract

급성골수성백혈병은 미분화된 골수세포가 무제한 증식하는 질환으로, 표준항암화학요법 및 조혈모세포이식의 발달로 치료 성적이 향상되었으나, 여전히 상당수에서 재발한다. 또한 급성골수성백혈병 환자의 반수이상이 65세 이상으로, 이 환자들에서는 충분한 용량의 항암제를 투여하기 어려운 경우가 많아, 현재도 생존율은 10%에 불과하다. 이러한 미충족수요를 해결하기 위하여, 부작용은 적으면서 효과적인 선택적 치료제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있으며, 그 대표적인 예가 분화유도치료이다. Isocitrate dehydrogenase는 isocitrate를 α-ketoglutarate로 변화시키는 효소이다. 급성골수성백혈병 환자의 10-12%에서 IDH2 유전자 돌연변이가 발견된다. 변이된 IDH 효소는 α-ketoglutarate를 β-hydroglutarate 시켜, 세포분화를 억제한다. AG-221은 IDH2 억제제로서 백혈병세포 분화유도를 통한 치료효과를 보임으로써, 2017년 8월 IDH2 돌연변이가 확인된 재발성 또는 불응성 급성골수성백혈병 환자 치료제로 미FDA 승인을 얻게 되었다. AG-221의 우수한 치료반응에도 불구하고, 단독요법으로 효능을 보이지 않는 급성골수성백혈병 환자를 위한 복합치료의 필요성이 제기되었다. 따라서, 본 연구는 IDH2 돌연변이가 확인된 급성골수성백혈병 세포에서 대표적인 분화유도치료제인 all-transretinoic acid (ATRA)와 AG-221 복합치료가 세포분화에 미치는 영향을 확인하고, 관련 기전을 알아보고자 하였다. IDH2 돌연변이 급성골수성백혈병 세포에 AG-221과 ATRA를 복합처리시에 세포 내 R-2-hydroxyglutarate (2-HG) 를 낮추고, 각 약제의 단독치료시보다 현저한 세포분화를 유도하였다. AG-221과 ATRA를 복합처리시 자가포식소체 형성과 관련한 자가포식 단백인 LC3-II 와 beclin-1 가 증가하고, 자가융해소체의 제거와 연관된 자가포식 단백인 p62/SQSTM1 의 감소는 관찰되지 않았다. 자가포식억제제인 3-methyladenine (3-MA) 처리시 AG-221과 ATRA 복합처리에 의한 세포분화의 감소를 보였다. 하지만, 자가융해소체 제거 억제제인 bafilomycin A1 처리시에는 AG-221과 ATRA 복합처리에 의한 세포분화에 영향을 미치지 않는다. 결과적으로 AG-221과 ATRA 복합처리에 의한 세포분화는 초기단계의 자가포식과 연관되어 있었다. IDH2 돌연변이 급성골수성백혈병 세포에서 AG-221과 ATRA 복합처리시 phospho-MEK1/2, phospho-EKR1/2의 증가 및 MEK 억제제 또는 RAF 억제제에 의한 세포분화 감소를 관찰함으로써 RAF- 1/MEK/ERK 경로의 활성화가 AG-221과 ATRA 유도 세포분화와 관련이 있음을 확인하였다. 또한, Western blot analysis 를 통해 IDH와 연관된 histone methylation 단백이 AG-221과 ATRA 복합처리시 감소함을 관찰하였다. AG-221과 ATRA 복합치료는 정상세포의 부작용은 덜하고, 효과가 있는 항암치료법으로, 급성골수성백혈병 치료에 있어서 중요한 이슈인 고령 환자, 특히 현재의 유도요법을 적용할 수 없는 환자에서 새로운 대안이 될 가능성이 있다. 또한, 관련 기전에 대한 추가적인 연구를 통해 세포분화와 연관된 표적 개발은 급성골수성백혈병 환자치료에 도움이 될 것으로 판단된다. A block in the myeloid differentiation is a hallmark of acute myeloid leukemia (AML). When these undifferentiated cells acquire properties that provide a proliferation advantage, AML may arise. It has long been hypothesized that overcoming the differentiation block in AML would be an important component of improved treatment regimens. Mutations in isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) are observed in 10% to 12% of patients with AML. The specific pharmacological inhibition of mutant IDH reduces the levels of R-2-hydroxyglutarate (2-HG) and restores cellular differentiation in vivo and in vitro. The IDH2 inhibitor, enasidenib (AG-221) was approved by the FDA as a first-in-class inhibitor for the treatment of relapsed or refractory (R/R) IDH2-mutant AML. It is expected that for more powerful responses, differentiation-based IDH2 inhibition will need to be combined with other types of mechanism-based target therapy. In this study, the effects of a combination of all-trans retinoic acid (ATRA) and AG-221 on the differentiation was explored. Moreover, the mechanisms employed by IDH2 mutant in AML was investigated. AG-221 and ATRA combination treatment inhibited 2-HG production and resulted in synergistic effects of the differentiation in IDH2 mutant AML cells and primary AML cells expressing IDH2 mutation. AG-221 and ATRA combination treatment altered the autophagic activity leading to substantial accumulation of autophagosomes without an increase in the degradation of autophagic vacuoles, as assessed by the elevation of LC3-II and beclin-1 protein levels as well as no significant decrease of p62/SQSTM1 protein levels. Autophagy inhibition using pharmacological inhibitor, 3-methyladenine (3-MA) resulted in the decrease of AG-221 and ATRA-induced differentiation in IDH2 mutant AML cells. However, decrease in AG-221 and ATRA-induced differentiation following cotreatment with the autophagic degradation inhibitor bafilomycin A1 in IDH2 mutant AML cells was not observed. Taken together, the results indicate that AG-221 and ATRA treatment induced differentiation of IDH2 mutant AML cells was associated with autophagy induction, without suppressing autophagy flux at maturation and degradation stage. RAF-1/MEK/ERK pathway was founded to be associated with AG-221 and ATRA-induced differentiation in IDH2 mutant AML cells. MEK or RAF inhibition using the pharmacologic inhibitor suppressed AG-221 and ATRA combination on the differentiation in IDH2 mutant AML cells. IDH-associated changes in histone methylation markers decrease after AG-221 and ATRA combination treatment. Furthermore, preliminary evidence showing that addition of ATRA may lead to any further improvement or increase the response rate in IDH2 mutant AML patients who could not benefit from IDH2 inhibitors is presented. I expect that further studies will advance our understanding of how best to target this process and harness the therapeutic benefits.