Human amniotic fluid-derived stem cell patch affects the healing process of burn wound

Abstract

급성 화상의 조기 치료, 특히 그 부위가 광범위할 경우에는 혈역학적 감시와 감염 예방, 상처 치유를 위한 재상피화가 필요하다. 특히 중증 소아 화상에서는 소생술이 신속히 이루어지는 것이 환자의 생존에 매우 중요하다. 소아에서도 치료의 원칙은 성인과 유사하지만 소아는 화상에 대한 고유한 병리 생리학적 반응을 보이므로 소생술, 기도 관리, 화상 및 상처 관리의 차이점에 대한 이해는 치료를 위한 필수적인 요소이다. 심한 화상은 모든 장기 시스템에 영향을 미치고, 화상의 중증도는 전체 신체 표면적 중 화상의 범위(%) 및 화상 깊이와 관련이 있다 다양한 화상 치료방식이 개발되었지만, 광범위한 화상 및 전체 피부층을 파괴하는 상처는 여전히 환자에게 신체적 손상뿐 아니라 심리적으로도 큰 상처를 준다. 화상 치료에서의 중간엽 줄기세포의 적용은 보다 나은 치료결과를 보일 것으로 기대된다. 사람의 신체에는 화상 상처부위에 적용될 수 있는 줄기세포의 공급원이 다양하게 있다. 중간엽 줄기세포의 다양한 공급원 중에서, 양수유래 줄기세포는 높은 증식 능력, 다능성, 다양한 면역 조절 기능 및 세포의 면역 반응의 감소로 화상 치료에 장점이 있다. 이 연구에서 우리는 많은 다공성 구조로 세포 부착 및 전달에 적합한 poly (L-lactide-co-glycolide) (PLGA) 스캐폴드 패치를 개발했다. 본 연구에서는 양수유래 줄기세포 (Amniotic Fluid Stem Cells, AFSCs)를 스캐폴드 패치에 부착시키고 화상 상처치료에서의 치료 효율을 동물 모델에서 평가하였다. 양수유래 줄기세포는 3 기 임산부로부터 얻어졌다. 스캐폴드 패치상에서 세포를 확 장시키며 배양을 진행하였다. 스캐폴드 패치 및 부착된 세포의 구조는 주사 전자 현미경에 의해 평가되었다. 무 흉선 누드 래트의 등 부위 영역에서 끓는 물에 의해 가열된 황동 삼각 화상 유발체에 의해 전체 피부에 대한 화상이 유발되었다. 화상을 입힌 다음날 에스카를 제거하고 양수유래 줄기세포 함유 스캐폴드 패치 (치료 그룹, n = 5) 및 무 세포 스캐폴드 패치 (대조군, n = 4)를 상처 부위에 적용하였다. 스캐폴드 패치 적용 7 일 후, 래트를 희생시키고 상처 부위를 둘러싼 피부의 전체 두께를 샘플링 하였다. 샘플링 된 피부를 상처의 중심에서 이등분한 다음, 절반을 조직학적 평가를 위해 포름알데히드로 고정시키고 다른 절반을 웨스턴 블롯을 위해 냉동 보관하였다. 조직 학적 평가에서, 섬유화는 진피의 거의 전체를 수반하고 피하 근육까지 접하는 것이 관찰되었다. 현미경적으로 상처는 괴사부분을 제외하고 재상피화되었다. 재상피 편평상피로 덮인 진피는 불규칙한 콜라겐 밴드를 보여주었다. 재상피화의 정도는 실험군에서 통계학적으로 유의하게 증가하였으며, 콜라겐 밴드의 불규칙성과 크기 역시 대조군보다 치료군에서 더 두드러졌다. Transforming growth factor-β(TGF-β)의 발현은 실험군에서 대조군보다 7 배 이상 증가하였으며 통계학적으로 유의하였다. VEGF-A (Vascular endothelial growth factor)발현은 두 그룹간에 차이가 없었으며, VEGF-B 발현은 실험군에서 증가하는 경향을 보였지만 통계학적 유의성을 얻지 못했다. 결과적으로, 미리 준비된 AFSCs 함유 PLGA 나노 패치는 급성 화상 환자의 초기 단계에서 즉시 사용될 수 있는 새로운 치료 방법의 가능성이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 이 방법은 드레싱 효과뿐만 아니라 세포 치료 효과도 달성할 수 있을 것으로 기대된다. Early treatment of acute burn injury, especially in the case of extensive injury, requires hemodynamic maintenance, prevention of infection, promotion of wound healing processing and re-epithelization. The effectiveness of dressing treatment, which should be performed early in the emergency department, is critical to determining the patient's prognosis. Many dressing methods and materials have been proposed from the past and various cell treatment methods have been tried in the early stage of burn in order to promote wound healing and re-epithelization. Currently, cell-based, engineered skin substitutes are showing promise for the treatment of acute and chronic wounds such as deep and partial burns, ulcers resistant to conventional therapies and surgical wounds. The knowledge on the stem cell biology has been dramatically increased for last several years and attempts for applying stem cells to burn wound treatment has been introduced. Stem cell-based therapies have the potential to enhance cutaneous regeneration, largely through trophic and paracrine activity. Among various sources of mesenchymal stem cells (MSCs), amniotic fluid-derived stem cells (AFSCs) are attractive due to their high proliferation capacity, multipotency, immunomodulatory activity and lack of significant immunogenicity. In this study, we developed poly (L-lactide-co-glycolide) (PLGA) scaffold patches which have highly porous structure and suitable for cell attachment and delivery. AFSCs are attached to these scaffold patches and their therapeutic efficiency in burn wound care was evaluated in animal models. AFSCs were collected from a third-trimester pregnant woman. Cells were expanded and cultured on scaffold patches. Ultrastructure of scaffold patches and attached cells were evaluated by scanning electron microscopy. Full-thickness burn was induced by tripod brass comb heated by boiling water in paravertebral area of athymic nude rats. Eschar was removed one day after burn and AFSCs-laden scaffold patches (patch with cell group, n=5) and cell-free scaffold patches (patch only group, n=4) were applied to wound site. Seven days after scaffold patch application, the rats were sacrificed and whole thickness of skin surrounding wound sites was sampled. The specimen was bisected at the center of the wounds, then one half was fixed in formaldehyde for histologic evaluation and the other half was stored in deep freezer for western blotting. In histologic evaluation, the fibrosis involves almost whole thickness of the dermis and abuts subcutaneous muscle. Microscopically, the wounds were re-epithelialized except in necrotic portion. Dermis covered by re-epithelialized squamous epithelium shows thick irregular collagen bands and Percentage of burn wound re-epithelialization was statistically significant in patch with cells group. The irregularity and size of collagen bands were more prominent in patch with cell group than patch only group. Transforming growth factor-β (TGF-β) expression was more than seven-times prominent and statistically significant in patch with cell group than in patch only group. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-A expression was not different between two groups and VEGF-B expression showed a trend of increase in patch with cell group but did not obtain statistical significance. Consequently, pre-prepared AFSC laden PLGA nano-patches suggested the possibility of one of the new methods that can be used immediately in the early stage of acute burn patients. In addition, this method could achieve cell treatments as well as dressing effects.