Microbiome and mycobiome profiling of house dust mites and their significance in allergic inflammation

Abstract

천식, 비염 및 아토피 피부염과 같은 알레르기 질환은 전 세계적으로 가장 흔한 만성 질환이다. 집먼지진드기는 알레르기 질환을 유발하는 알레르기 유발원이다. 집먼지진드기의 세균총은 내독소와 같은 미생물 유래 물질을 생성하여 알레르기 질환의 병인에 면역 조절 효과를 발휘할 수 있다. 그러나, 알레르기 면역반응에 대한 집먼지진드기의 세균총의 효과에 대해서 알려진 바가 거의 없다. 이 연구의 목적은 집먼지진드기의 세균총을 연구할 수 있는 분석 파이프라인을 결정하고 알레르기 질환 발생에서의 집먼지진드기 세균총의 역할을 규명하는 것이다. 이를 위해 제 1장에서는 차세대 염기서열분석을 이용한 16SrRNA amplicon분석이 수행되었다. Bartonella 및 Enterococcus 속은 큰다리먼지진드기 (Dermatophagoides farinae)의 세균총의 약 99 %를 구성했다. 여러 염색 방법을 통해 Enterococcus faecalis가 장내에, Bartonella는 혈강에 분포하는 것이 확인되었다. 집먼지진드기의 세균총의 변화가 알레르기 질환의 발달에 영향을 미치는지 확인하기 위해 큰다리먼지진드기에 암피실린을 처리하고 6주 동안 사육하였다. 결과적으로 진드기 내의 세균총의 양은 25 배 감소했고, 내독소 농도는 100 배 감소했다. 또한, 항생제를 처리한 진드기의 추출물로 사람 기관지 상피세포주 (BEAS-2B)에 처리하면 염증성 사이토카인인 IL-6 와 IL-8의 분비가 정상 진드기의 추출물의 경우 보다 감소되었다. 큰다리먼지진드기의 세균총인 E.faecalis를 배양하여 진드기에 접종 시켰고, 2주 후 형광 현미경 검사와 박테리아 DNA 정량을 통해 박테리아가 큰다리먼지진드기의 장 내에 정착되었음을 확인하였다. 이때, BEAS-2B 세포로부터의 IL-6 및 IL-8 분비는 대조군 진드기 추출물과 비교하여 E. faecalis가 접종 된 경우 더 높게 측정되었다. 마우스 천식 모델에서, 항생제 처리 진드기의 추출물을 처리하였을 때 알레르기성 기도 염증반응이 대조군 진드기 또는 E. faecalis 접종 진드기 그룹과 비교하여 낮게 나타났다. 결론적으로, 집먼지진드기의 세균총은 in vitro와 in vivo에서 알레르기성 염증 반응에 대해 보조제 (adjuvant)로서 작용하여 시너지효과를 보이는 것으로 나타났다. 제 2장에서는 큰다리먼지진드기와 세로무늬먼지진드기 (D. pteronyssinus) 및 긴털가루진드기 (Tyrophagus putrescentiae)의 추출물을 기도 상피 세포주 (BEAS-2B)에 처리하고 전사체 분석 (RNA-Seq)을 수행하여 비교하였다. Pathway 분석에서 박테리아에 대한 면역 반응은 큰다리먼지진드기 처리군에서만 확인되었다. 큰다리먼지진드기는 다른 진드기 종보다 많은 양의 세균총과 내독소를 가져서 BEAS-2B cells에서 염증성 사이토카인 분비를 강화시키는 것으로 나타났다. 항생제 대사에 관한 pathway는 세로무늬먼지진드기 처리 군에서 높았는데 조사결과 이 진드기 종은 높은 진균 함량을 보였다. 또한 E. faecalis를 진드기에 접종한 실험에서 항진균제인 암포테리신이 세로무늬먼지진드기에서 E.faecalis의 생존을 높이는 것이 확인했고 이는 집먼지진드기 내의 진균 (mycobiome)이 세균총을 억제할 수 있다는 것을 시사한다. Allergic diseases such as asthma, rhinitis, and atopic dermatitis are the most common chronic diseases worldwide. The house dust mite (HDM) is a well-known allergen source of allergic diseases. Characterization of the HDM microbiome is important because it may exert immunomodulatory effects on the pathogenesis of allergic diseases, owing to its ability to generate microbe‐associated molecules such as lipopolysaccharide (LPS). However, little is known about the effects of the HDM microbiome on allergic immune responses. The purposes of the study were determining the appropriate microbiome analysis pipeline for HDM and elucidating the role of HDM microbiome in allergic disease development. To this end, in chapter I, 16S rRNA amplicon analysis using high‐throughput sequencing technology was performed. Bioinformatics analyses were performed using three different pipelines to determine the appropriate method for the HDM microbiome analysis. The genera Bartonella and Enterococcus constituted approximately 99% of the microbiome of Dermatophagoides farinae; this finding was supported by 16S rRNA cloning. Staining methods for D. farinae showed that Enterococcus faecalis was distributed throughout the intestine and Bartonella was detected in the haemocoel. To determine whether the change in the microbiome in HDM affects allergy development, the mites were cultured in medium containing the ampicillin for six weeks, which reduced the amount of bacteria in mites 25-fold. The LPS concentration in mite extract was reduced by 100-fold by antibiotics. Furthermore, treatment of a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) with an extract of antibiotic-treated mites significantly reduced the secretion levels of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8. E. faecalis, the predominant bacterium of D. farinae, was cultured and inoculated into the mite. Two weeks after inoculation, fluorescent microscopy and bacterial DNA quantification showed that the bacteria were settled in the gut of D. farinae. IL-6 and IL-8 secretion from BEAS-2B cells was increased when treated with the extract of the E. faecalis-inoculated mite compared in the control mite extract. In the mouse asthma model made by the antibiotics-treated mite, reduced allergic airway inflammation was found in bronchoalveolar lavage cell counting and lung histological examinations compared to the control mite or the E. faecalis-inoculated mite. In conclusion, the microbiome of HDM played a synergistic role in allergic inflammation in vitro and in vivo. In chapter II, a transcriptomic analysis (RNA-seq) of airway epithelial cells (BEAS-2B) was performed to compare gene expression patterns after treatment with extracts from the three species of mites (D. farinae, D. pteronyssinus, and T. putrescentiae). Based on the pathway analysis, immune responses to bacteria increased only in the D. farinae-treated group, because this species harbored a larger amount of bacteria than the other mites, and the high LPS level in D. farinae caused airway epithelial cells to produce higher levels of pro-inflammatory cytokines. Subsequent experiments began with the knowledge that antibiotic metabolic pathways were enriched in D. pteronyssinus-treated cells but not D. farinae-treated cells. D. pteronyssinus had a large amount of fungi that were considered to inhibit bacterial survival in the mite. In conclusion, HDM mycobiomes inhibit microbiomes and this interaction may be related to allergic responses.