Characterization of leukocyte migration pattern depending on EphA2 in bleomycin-induced lung injury

Abstract

The Eph (Erythropoietin-producing hepatoma) receptor and ephrin (Eph receptor interacting protein) expressed on endothelium affect endothelial permeability and regulate the passage of fluid and immune cells from blood into the interstitial tissue via paracellular spaces. Eph/ephrin protein expressed on immune cells modulates cell trafficking in a ligand dependent manner and Eph receptor itself mediates ligand independent promotion of cell migration and can also interact with integrins to regulate cell adhesion in cancer cell. It was known that EphA2 receptor deficiency reduces bleomycin lung injury but, whether EphA2 receptor regulates cell transmigration and retention are not certain. In this study, acute lung inflammation was established in wild-type and EphA2 deficient mice using bleomycin, respectively. Lung infiltrated neutrophils were detected by flow cytometry and H&E staining method. To investigate how migratory pattern of neutrophil depends on EphA2 receptor, in vitro migration assay was performed using isolated neutrophils from bone marrow. Neutrophil migration in naïve and inflammatory state was monitored in time-lapse manner under two-photon intravital imaging. 5 mg/kg and overdose of bleomycin induced severe expansion of alveolar septa and recruitment of immune cells in lung tissue. 3 hours after bleomycin injection, recruitment of neutrophils was significantly increased compared to naïve state but, there were no significant differences in population of infiltrated neutrophils. In vitro migration assay showed that EphA2 deficient neutrophils have more active migration pattern than wild-type. Bleomycin decreased migration index including track length, displacement and velocity compared to naïve state but there was no significant difference between wild-type and EphA2 deficient mice in vivo. Taken together, results showed that EphA2 receptor expressed on neutrophils can modulate neutrophil migration in ligand-independent manner in vitro but not in vivo state, due to the complexity of in vivo systems and the diversity of factors that can modulate neutrophil migration simultaneously. Lung inflammation is initiated with neutrophil recruitment, so EphA2 receptor can be target for regulating neutrophil migration and inflammation process. 혈관 내피 세포에서 발현하는 Eph 수용체와 ephrin은 혈관 투과성에 영향을 주어, 혈류나 면역 세포가 내피 세포의 사이에 있는 공간을 통과하여 세포간 조직으로 이동하는 것을 조절한다. 면역 세포에서 발현하는 Eph/ephrin 단백질은 리간드 의존적인 방식으로 면역 세포의 교통을 조절하며, 암세포에서 Eph 수용체는 리간드 비의존적인 방식으로 인테그린과 작용하여 세포 부착을 조절한다고 알려져 있다. EphA2 수용체 결손은 bleomycin에 의한 폐 손상을 감소시킨다고 알려져 있지만 EphA2 수용체가 세포의 혈구누출과 정체에 영향을 주는지는 알려지지 않았다. 본 연구에서는 EphA2 knock out (KO) 마우스와 대조군인 C57BL/6J 마우스에 bleomycin으로 급성 염증 반응을 유도하고, 폐에 침윤된 호중구를 유세포 분석과 H&E 염색으로 확인하였다. EphA2 수용체에 의해 호중구의 이동 양상이 달라지는 지 확인하기 위해 골수에서 분리한 호중구를 이용하여 in vitro 세포 이동 분석을 진행하였다. 또한, 이광자 현미경을 이용한 생체 이미징을 진행하여 정상 상태와 염증 상태에서, EphA2 수용체 유무에 따른 호중구의 움직임을 분석하였다. 5mg/kg 이상의 bleomycin은 폐포 중격의 확장을 유도하였으며, bleomycin 투여 3시간 후, 폐에 침윤된 호중구의 수는 정상 상태일 때 보다 증가하였지만, EphA2 KO 마우스와 대조군간의 차이는 존재하지 않았다. In vitro에서 EphA2 결손 호중구는 대조군보다 높은 이동 길이와 속도를 보였고, in vivo에서 bleomycin은 세포 이동을 감소시켰지만, EphA2 KO과 대조군과의 차이는 존재하지 않았다. 따라서, 호중구에 존재하는 EphA2 수용체는 리간드 비의존적인 방법으로 세포 이동을 조절할 수 있지만, in vivo에서는 호중구의 이동을 조절하는 다양한 요소들이 복합적으로 작용하기 때문에 EphA2의 영향이 크지 않은 것으로 보인다. 염증은 호중구의 모집으로 시작하기 때문에, EphA2는 호중구의 이동과 면역 반응을 조절하는 타겟이 될 수 있다.