Activation of Wnt signaling reduces the population of cancer stem cell in ameloblastoma

Abstract

암 줄기세포(Cancer stem cells, CSCs)는 비대칭 분열에 의해 종양의 이질성(heterogeneity)에 기여하는, 무제한 자가 재생능력(self-renewing)을 가진 종양 세포의 아집단(subpopulation)이다. 임상적으로, CSCs는 방사선 치료 및 항암 화학 치료에 대한 내성을 보이며, 종양의 재발에 원인이 되는 것으로 알려져있다. 치성 상피성 종양인 법랑모세포종(ameloblastoma)은 성장 속도가 비교적 느리고, 전이 되지 않는 특성으로 인해 양성 종양으로 분류된다. 그러나, 법랑모세포종은 국소적 재발이 아주 흔하고, 약 1%에서 악성 변화 및 전이가 관찰된다. 아직까지 법랑모세포종은 방사선 요법이나 약물 요법으로 치료가 어려운 것으로 알려져 있다. 이 때문에 법랑모세포종의 치료는 병소 주변부를 포함하는 광범위한 외과적 절제술을 요하며, 환자의 악골에 큰 결손을 남긴다. 본 연구의 목적은 AM-1 세포를 사용하여 법랑모세포종의 CSCs를 확인하고, 이 CSCs에 Wnt 신호 전달 활성화제의 효과를 규명하고자 함이다. 먼저 잘 알려진 인간 법랑모세포종 세포주(cell line)인 AM-1 세포를 유세포 분석법(flow cytometry)을 사용하여 분석 하였다. 이때 획득 된 세포 중에서 CSCs로 의심되는 세포를 확인하기 위해 면역 염색을 하였다. 면역 염색에 의해 CSCs로 식별 된 세포에 대한 Wnt 신호 전달 활성화제를 적용하여 효과를 규명하 였다. 상기의 연구과정을 통하여 아래와 같은 결과를 얻었다. 1. AM-1 세포는 세포 형태에서 상당한 이질성을 나타내었다. 가장 큰 세포는 가장 작은 세포보다 12 배 더 크며, 원형에서 비정질에 이르는 다양한 형태의 세포가 관찰되었다. 2. 면역 세포 화학 분석 결과 소형 및 원형 세포가 증식하였으며, 이들 세포가 dental epithelial stem cells (DESCs), SRY related HMG-box-2 (Sox2)의 마커를 발현시켰다. 3. 세포에서의 Sox2 발현은 Wnt 신호 전달의 활성화와 음의 상관 관계가 있었다. 4. 현탁 배양에서 회전타원체(spheroid)의 형성과, 누드 마우스의 제 1 대구치 추출에 orthotopic graft를 통해 AM-1 세포의 줄기 세포와 같은 특성을 확인하였다. 5. 리튬 클로라이드 (LiCl) 및 발프로산 (valproic acid, VPA)을 사용한 Wnt 신호의 외인성 활성화는 세포 크기를 증가시키고 세포 증식 및 Sox2의 표현을 감소시켰다. 이번 연구를 통해 AM-1에서 CSCs로 추정되는 세포군을 확인할 수 있었다. 이는 법랑모세포종의 CSCs연구의 체외(in vitro) 및 생체외(ex vivo) 모델로 AM-1을 사용할 수 있는 가능성을 보여주었다. 그리고 Wnt 신호 전달의 활성화를 통해 AM-1에서 CSCs 세포군의 감소와 회전타원체의 감소를 확인할 수 있었다. 이를 통해 Wnt 신호 전달의 활성제의 법랑모세포종 치료 및 재발 억제를 위한 약물로서의 가능성을 확인하였다. 핵심 되는 말: 암 줄기세포, 법랑모세포종, Wnt 신호전달, AM-1 Cancer stem cells (CSCs) are a self-renewing subpopulation of tumor cells that contribute to the heterogeneity of tumors by asymmetric division. Clinically, CSCs are believed to be responsible tumor recurrence, displaying resistance to radiotherapy and chemotherapy. Ameloblastoma, a tumor of the odontogenic epithelium, is classified as a benign tumor owing to its slow growth rate and non-metastatic features. However, local recurrence of ameloblastoma is very common, and malignant changes and metastases are observed in about 1%. It has been reported that ameloblastoma is difficult to treat with radiation therapy or drug therapy. Because of this, treatment of ameloblastoma requires extensive surgical resection, including the periphery of the lesion, leaving a large defect in the patient's jaw. The purpose of this study is to identify the CSCs of ameloblastoma using AM-1 cells and to investigate the effect of Wnt signal activator on the CSCs. First, AM-1 cells, a well-known human ameloblastoma cell line, were analyzed using flow cytometry. Immunostaining was performed to identify cells suspected of CSCs among the obtained cells. The effect of applying Wnt signal activator to the CSCs was investigated by immunostaining. Through the above study process, the following results were obtained. 1. AM-1 cells exhibited significant heterogeneity in cell morphology. The largest cell was 12 times larger than the smallest cell, and various shapes of cells, from round to amorphous, were observed. 2. Immunocytochemistry analysis showed that small-sized and round-shaped cells were proliferative and expressed a marker of dental epithelial stem cells (DESCs), SRY related HMG box 2 (Sox2). 3. Sox2 expression in cells was negatively correlated with activation of Wnt signaling. 4. In vitro spheroid-forming assay and the orthotopic graft of the cell-sheet into first molar extracted region of nude mice confirmed the stem cell-like characteristics of AM-1 cells. 5. Exogenous activation of Wnt signaling using lithium chloride (LiCl) and valproic acid (VPA) increased the cell size and decreased proliferation and expression of Sox2. This study confirmed the putative CSCs population in AM-1. This confirmed the possibility of using AM-1 as an in vitro and ex vivo model for the study of CSCs in ameloblastoma. And reduction of CSCs cell population and reduction of spheroid in AM-1 were confirmed through activation of Wnt signaling. Through this, the possibility of activating Wnt signaling as an agent for treatment of ameloblastoma and suppression of recurrence was confirmed. Keywords: cancer stem cells, ameloblastoma, Wnt signaling, AM-1