Changes in cellular regulatory factors before and after decompression of odontogenic keratocyst

Abstract

Decompression followed by enucleation, one treatment for odontogenic keratocyst (OKC), is frequently used in OKC lesions of large sizes. This method offers the advantage of minimizing the possibility of sensory impairment without creating a wide-range bone defect; moreover the recurrence rate can be significantly lower than following simple enucleation. This study aimed to assess the changes in histology and expression of proliferation markers in OKC before and after decompression treatment. A total thirty eight OKC tissue samples from nineteen patients who had undergone decompression therapy were examined morphologically and immunohistochemically to observe changes in proliferative activity before and after decompression. The markers used for IHC staining were Bcl-2, EGFR, Ki-67, P53, PCNA, and SMO. The immunohistochemistry (IHC) positivity of the six markers was scored by using software ImageJ, version 1.49, by quantifying the intensity and internal density of IHC stained epithelium. The results are as follows: 1. Progress after decompression was certain. The size of lesion had reduced, and the bone density on panorama x-ray was observed to be thickened. The decompression periods of the patients ranged between 4 months to 12 months, the average period being 7.3 months. After decompression periods, enucleation was performed. 2. The tissues of OKC showed differences before and after the decompression procedure. At the time of decompression, the cystic cavity wall was constructed of fibrous tissue covered by very thin regular parakeratinized stratified squamous epithelium which had five to eight layers. The basal cells consisted of columnar cells and palisading nuclei. Many epithelia were separated from the fibrous capsule. There was very loose connection between epithelium and connective tissue without rete pegs. 3. The tissues obtained at the time of enucleation had changed, the cyst wall epithelium having become hyperplastic stratified squamous epithelium and dense connective tissue with infiltration of inflammation cells. 4. Bcl-2 staining was expressed in the basal layer of the epithelium. However, in some samples, Bcl-2 positive cells were observed in all layers of the lining epithelium and connective tissue cells of OKCs. EGFR showed membranous and cytoplasmic staining of epithelial cells, progressively diminishing from the basal toward the superficial layers. Its expression was prominent in basal epithelial cells. Ki-67 positive cells were mainly distributed in the basal and parabasal layers of epithelium. PCNA showed an abundant expression in both basal and suprabasal areas. P53 positive cells were seen throughout the epithelium but mainly in the parabasal layers. Positive immunostaining of SMO was detected in the intermediate layer, but rarely in the superficial and basal layer. 5. Bcl-2, Ki-67, P53, and PCNA staining were confined to the epithelial cell nucleus of OKC. EGFR and SMO staining were confined to the cell membrane of epithelium. The positivity of the 6 markers after decompression showed similar patterns. 6. The quantified values of the six markers showed both increase and decrease without displaying a tendency before and after decompression. 7. The paired t-test was applied to numerical parameters of the 6 markers obtained by quantifying the IHC staining in terms of intensity. The values of EGFR before and after decompression resulted in a P-value of 0.040, which was considered significant. However, values of P53, SMO, Bcl-2, Ki-67, and PCNA before and after decompression yielded P-values of 0.370, 0.373, 0.785, 0.678, and 0.271 individually, which were considered not significant. Statistics of EGFR values showed no significant difference between maxilla and mandible. 8. The other method for quantifying IHC staining was by using the internal density. Statistic evaluation of numerical parameters of P53, SMO, Bcl-2, Ki-67, and EGFR was performed using the Wilcoxon signed ranks test, yielding P-values of 0.968, 0.372, 0.147, 0.355, and 0.904, respectively. The paired t-test was used on numerical parameters of PCNA, yielding a P-value of 0.781. No P-values were considered significant. Based on the above findings, the values of Bcl-2, Ki-67, P53, PCNA, and SMO in OKC before and after decompression showed no significant change. No correlation between clinical shrinkage and morphologic changes or expression of proliferation and growth markers could be found. There was no statistical evidence that decompression treatment reduces potentially aggressive behavior of OKC within the epithelial cyst lining itself. This might indicate that decompression does not change the biological behavior of the epithelial cyst lining, as well as the recurrence rate. 감압술 후 낭종적출술은 치성 각화낭의 치료방법 중 하나이다. 이 방법은 크기가 비교적 큰 치성 각화낭 병소에 주로 적용된다. 이 방법의 장점은 넓은 골 결손부를 형성하지 않고 감각 저하 가능성을 최소화 할 수 있으며 단순 낭종적출술에 비하여 재발률을 줄일 수 있다. 본 연구의 목적은 치성 각화낭에 감압술 시행 전과 후의 세포 조절 인자의 변화를 관찰하여 치성 각화낭의 증식 활성의 변화를 규명하고자 하였다. 19명의 환자가 감압술 후 낭종적출술을 시행할 때 각 단계에서 조직검사를 위해 조직을 채취하였다. 총 38개의 치성 각화낭 조직에 형태학적인 검사와 면역조직화학 검사를 시행하여서 감압술 전과 후의 증식 활성의 변화를 관찰하였다. 면역화학조직 염색을 위해서 사용된 마커는 Bcl-2, EGFR, Ki-67, P53, PCNA 과 SMO 였다. 표피 염색 발현의 강도와 내적 밀도를 각각 수치화하기 위하여 ImageJ 라는 컴퓨터 프로그램을 사용하였다. 상기 연구 과정을 통하여 아래와 같은 결과를 얻었다. 1. 감압술 시행 후의 변화 과정은 분명했다. 병변의 크기는 감소하였으며, 방사선학적으로 골밀도가 두꺼워지는 것이 관찰되었다. 환자들의 감압술 시행기간은 4개월에서 12개월 사이였으며, 평균 7.3 개월이었다. 이 후에 낭종적출술을 시행하였다. 2. 치성 각화낭의 조직은 감압술 시행 전과 후의 차이를 보였다. 감압술을 시행하였을 때 채취한 조직에서, 낭 내강의 벽은 섬유성 조직이 매우 얇은 5~8 층 정도의 세포 두께를 가지는 부전 각화 중층편평상피로 덮혀 있었다. 기저세포는 입방형 세포와 책상배열을 한 핵으로 구성되어 있었다. 흔히 섬유피막으로부터 피복상피가 박리되어 있었다. 결합조직과 상피 사이의 결합은 매우 약하게 이루어져 있었으며 상피돌기의 소실을 보였다. 3. 낭종적출술을 시행할 때 얻은 조직에서 변화된 모습이 관찰되었다. 낭종 벽의 상피는 과증식된 중층편평상피와 염증세포의 침윤이 일어난 촘촘한 결합 조직으로 변화하였다. 4. Bcl-2 염색은 상피의 기저층에 발현하였다. 하지만 일부 조직에서는 상피 표면과 결합조직의 전 층에서 발현을 관찰할 수 있었다. EGFR 염색은 상피세포의 막과 세포질에서 발현이 되었고 기저층에서 표층을 향하여 점차적으로 감소하는 모습을 보였다. Ki-67 염색은 상피의 기저층과 부기저층에서 주로 발현되었다. PCNA 은 기저층과 부기저층에서 모두 풍부한 발현을 보였다. P53 염색은 상피에서 전반적으로 관찰되었으며 주로 부기저층에서 발현되었다. SMO 염색은 주로 중간층에서 발현되었다. 5. Bcl-2, Ki-67, P53 과 PCNA 염색은 치성 각화낭의 상피세포 핵에 국한하여 발현이 관찰되었다. EGFR 과 SMO 염색은 상피의 세포막에서 발현이 관찰되었다. 낭종적출술 시행시 채취한 조직에서도 6 가지 마커는 비슷한 양상의 염색 발현을 보였다. 6. 6 가지 마커의 염색 발현을 수치화한 값은 감압술 시행 전과 후에 특정한 경향을 보이지 않고 증가와 감소를 모두 보였다. 7. 6 가지 마커의 염색조직화학검사를 염색강도로 수치화한 값을 사용하여 대응표본 t 검정을 시행하였다. 감압술 시행 전과 후의 EGFR 수치는 유의확률수치가 0.040으로 통계적인 유의성을 보였다. 하지만 감압술 시행 전과 후의 P53, SMO, Bcl-2, Ki-67, PCNA 는 유의확률수치가 각각 0.370, 0.373, 0.785, 0.678, 0.271 로 통계적인 유의성은 관찰되지 않았다. EGFR 수치에서 상악군과 하악군 사이에 통계적인 유의성은 관찰되지 않았다. 8. 다른 방법으로 염색조직화학검사를 내부 밀도를 사용하여 수치화하였다. P53, SMO, Bcl-2, Ki-67, EGFR 수치에 윌콕슨 부호 순위 검정을 시행하였으며 유의확률수치는 각각 0.968, 0.372, 0.147, 0.355, 0.904 로 통계적 유의성은 관찰되지 않았다. PCNA 수치에 대응표본 t 검정을 시행하였으며 유의확률수치는 0.781로 통계적 유의성은 모두 관찰되지 않았다. 이상의 결과를 바탕으로, 감압술 전과 후의 Bcl-2, EGFR, Ki-67, P53, PCNA 과 SMO 의 염색 발현을 수치화한 값에서 통계적 유의성은 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 임상적인 낭의 수축과 형태학적인 변화나 증식 마커 또는 성장 마커 발현 간의 연관성은 관찰할 수 없었다. 감압술을 시행할 경우에 치성 각화낭 상피 표면 자체의 잠재적인 공격성이 감소한다는 통계적인 증거는 찾을 수 없었다. 이는 감압술이 치성 각화낭 상피 표면의 생물학적인 행동을 변화시키지 않을 수도 있다는 점을 나타내며, 또한 치성 각화낭에서 감압술을 시행하여도 재발률을 감소시키지 않는다고 생각해 볼 수 있다.