Dissection of roles of dendritic cells in the pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis and their implications in novel strategies for improved control of tuberculosis

Abstract

결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)은 사람을 유일한 숙주로 하는 병원체로 결핵(tuberculosis)을 유발시키며, 결핵은 2018 년도 한 해에만 해도 150 만여 명을 사망에 이르게 하는 가장 심각한 감염 병이다. 결핵균이 발견된 이후, 100 년이 넘는 동안 결핵을 제어하기 위해 많은 연구가 진행되어 왔지만 결핵의 병인기전에 대한 이해는 아직도 미흡한 상태이다. 수지상 세포는 전문적인 항원제시세포(antigen presenting cell) 중 하나로서, 외부 항원에 의해서 성숙화 과정을 거친 후 배수 림프절(draining lymph node)로 이동하여 T 세포에 의한 항원 인식을 촉진하고 감염 미세환경에 따라 특정 T 세포의 편향화(polarization)를 유도한다. 결핵 제어를 위해 제 1 형 보조 T 세포(type 1 helper T cell, Th1) 면역의 형성이 중요하기 때문에, T 세포의 면역편향화를 조절하는 수지상 세포는 결핵 병인에서 중요한 역할을 수행한다. 하지만, 결핵균은 수지상 세포에 의한 효과적인 면역반응을 억제, 회피하는 기전이 존재 한다는 연구들이 지속적으로 보고되고 있기 때문에, 결핵의 발병과 방어에 관여하는 수지상 세포의 특징 및 역할을 이해하고, 이를 이용한다면 효과적인 결핵제어기법을 제시할 수 있다. 이에 본 학위 논문에서는 다양한 결핵 감염모델에서 형성되는 수지상 세포의 면역학적 표현형과 역할을 규명하고, 이를 이용하여 향상된 결핵예방 및 치료의 가능성을 연구하고자 하였다. 제 1 장에서는 결핵 발병과 방어 기전에 관여하는 수지상 세포의 역할과 T 세포와의 관계, 임상 시험 중인 결핵백신을 토대로 향후 효과적인 결핵백신과 제어기법 개발을 위한 수지상 세포의 활용 및 그 특성에 대한 문헌고찰과 최신 연구동향에 대한 내용으로 구성되어있다. 제 2 장에서는 동물실험 모델링 및 in vitro 실험을 통하여 수지상 세포와 결핵 감수성에 관한 상관관계와 수지상 세포의 기능을 밝히고자 하였다. 일반적으로 결핵균 감염모델에 사용되는 C57BL/6 마우스에 비해 결핵균 감염에 대해 높은 감수성(susceptibility)을 지닌 A/J 마우스의 경우, C57BL/6 마우스에 비해 낮은 빈도수의 수지상 세포 및 T 세포와, 약화된 Th1 반응 형성이 관찰되었다. 또한, 병원성이 서로 다른 결핵 균주들(Mtb K, H37Rv 및 H37Ra)의 감염을 통하여 마우스 모델에서 병원성과 반비례 하는 Th1 반응의 형성과, 수지상 세포상의 major histocompatibility complex (MHC) class II 분자의 억제를 확인하여, 결핵균 감염의 중증도와 T 세포 면역 그리고 수지상 세포에 대한 상관관계를 제시하였다. 또한, 병원성 결핵균주 H37Rv 또는 약독화 결핵균주 H37Ra 감염을 통해 병원성이 서로 다른 결핵균의 감염에 따른 수지상 세포의 표현형 및 기능적 변화와 T 세포와의 상호작용을 조사 하였다. H37Rv 감염-수지상 세포에서는 H37Ra 감염에 비해 더욱 높은 수준의 Th1 반응의 억제가 관찰되었고, 이는 H37Rv 감염을 통해 면역 억제성 사이토카인 중 하나인 Interleukin 10 (IL-10)의 분비에 의한 영향임을 확인하였다. 감염 초기부터 다량의 IL 10 의 분비가 유도된 H37Rv 감염-수지상 세포는 T 세포와의 상호작용을 위한 CD80, CD86 및 MHC class II 분자 발현의 저하와 programmed deathligand 1 (PD-L1), CD103, Tim-3 및 indoleamin 2, 3-dioxygenase 분자 발현의 증가를 통해 면역 관용성 수지상 세포로 유도됨을 확인하였다. H37Rv 감염-수지상 세포에서 관찰된 면역 관용성 표현형은 IL-10 결핍 마우스로부터 생성된 수지상 세포 또는 IL-10 중화 단일클론 항체로 처리 된 수지상 세포에서 정상적인 성숙 수지상 세포 표현형으로 회복 됨을 확인하였으며, T 세포와의 공동 배양에서도 T 세포의 증식 및 Th1 세포로의 분화가 회복 됨을 확인 함으로써, H37Rv 감염에 의해 유도되는 면역관용성 수지상 세포에 IL-10 이 핵심적인 역할을 하고 있음을 증명하였다. 추가적으로, H37Rv 감염에 의한 IL-10 의 분비는 p38 mitogenactivated protein kinases (MAPK) 활성화에 의해 매게 된다는 것을 확인 함으로써, p38 MAPK−IL-10 으로 이어지는 신호전달이 면역 관용성 수지상 세포의 형성에 중요함을 증명하였다. 결론적으로, 결핵의 중증도 및 결핵균의 병원성에 따른 수지상 세포의 표현형 및 기능의 특징을 규명하였고, 수지상 세포의 조절을 통해 효과적인 T 세포 면역을 유도함으로써 결핵균을 억제하는 전략에 대한 가능성을 제시하였다. 항원의 당화(glycosylation)는 항원제시세포의 항원인식 및 항원인식 이후에 유도되는 T 세포 면역반응에 영향을 줄 수 있다고 보고되었다. 특이하게도 결핵균은 다른 세균에 비해, 항원들의 당화가 전체 단백체 중에서 매우 높은 비중을 차지한다고 알려졌다. 따라서, 제 3 장에서는 향상된 아단위 백신(subunit vaccine) 개발을 위해 단백질 발현 후 당화과정을 가지는 단백질-식물발현시스템을 이용하여 항원을 확보하였고, 결핵백신으로서의 방어효과를 제시하였다. 객관적 비교를 위해 단백질- 박테리아 발현 시스템으로서 대장균(Escherichia coli)에서 발현 된 비 당화 Ag85A (NG-Ag85A)와 단백질-식물 발현 시스템으로서 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서 발현 된 당화 Ag-85A (G-Ag85A)의 백신 효능을 결핵균 감염 마우스 모델에서 비교 하였다. 결핵균 감염 마우스에서 분리한 T 세포에 각각의 항원을 자극한 결과 G-Ag85A 는 NGAg85A 에 비해 더욱 높은 항원성(antigenicity)을 보유함을 확인하였고, 각각의 항원으로 자극시킨 수지상 세포와 결핵균 감염 마우스 분리 T 세포의 공동 배양 결과에서 G-Ag85A 로 자극한 수지상 세포에서 더욱 높은 항원 특이적 IFN- 와 T 세포 증식을 확인하였다. 이러한 결과는, GAg85A 가 항원을 탐식하고 제시하는 수지상 세포를 통해 Th1 반응을 증가시킬 수 있는 결핵 백신 후보로서의 가능성을 보여준다. 결핵균 감염 후 4 주 및 9 주에 폐 조직 내 박테리아 성장 및 폐 조직 병변 분석 결과, G-Ag85A 로 면역화 된 마우스 그룹은 NG-Ag85A 면역화에 비해 더욱 높은 백신 효능을 나타냄을 확인하였고, 백신에 의해 유도된 결핵균 방어가 효과는 IFN-, TNF- 및 IL-2 를 공동 생성하는 항원특이적 다기능 CD4+ T 세포를 바탕으로 이루어짐을 확인 할 수 있었다. 결론적으로, 식물 단백질 발현 시스템을 이용한 당화된 백신 항원의 특징과 효능을 수지상 세포로부터 결핵균 동물모델을 통하여 보여줌으로써 결핵의 효과적인 예방을 위한 백신항원 개발에 새로운 전략을 제공하였다. 결핵의 제어를 위해서 효과적인 예방과 결핵 환자에 대한 효율적인 치료가 중요하다. 이를 위해서 새로운 백신 개발을 통한 결핵균 감염 억제 및 결핵 발병 억제와, 새로운 치료법을 통한 치료 기간 단축이 시급한 실정이다. 최근 수지상 세포를 표적으로 하거나 수지상 세포의 직접적인 이용을 통한 결핵백신 모델에서 높은 수준의 백신 효능이 보고되고 있다. 따라서, 제 4 장에서는 결핵균의 배양액을 농축한 분비항원(culture Filtrate antigens, CFA)으로 성숙시킨 수지상 세포(CFA-수지상 세포)를 사용하여 (i) BCG 프라임-부스터 백신으로의 가능성과, (ii) 약제 감수성 결핵(drug susceptible TB) 뿐만 아니라 약제 저항성 결핵(multidrug resistant TB) 의 치료효능을 증가시키기 위한 보조 면역 요법으로서의 가능성을 다양한 마우스 모델을 사용하여 평가 하였다. 마우스에 BCG 백신 후, CFA- 수지상 세포를 통한 BCG 프라임-부스터 백신은, BCG 단독 백신에 비해 종격동 림프절 (mediastinal lymph node) 및 폐 조직 내의 수지상 세포 와 T 세포의 침윤을 촉진하였고, 항원 제거 특화된 이펙터 메모리 T 세포(effector memory T cell) 및 항원에 대한 메모리 반응을 장기적으로 지속하는 센트럴 메모리 T 세포(central memory T cell)의 형성을 촉진함을 확인하였다. 또한, TNF-, IFN- 및 IL-를 동시에 생성하는 항원특이적 다기능 CD4+ T 세포의 현저한 증가와 함께 초기 감염 단계부터 상당한 박테리아 감소를 유도함을 확인하였다. 이 결과는 다양한 균 주의 결핵균 감염 모델에서도 동일한 보호 효능을 가졌으며, 부스팅 백신으로부터 26 주 후에도 보호 효능이 지속됨을 확인하였다. 항결핵 화학 요법에 대한 보조 면역 요법 실험의 경우, 항생제 치료와 함께 투여된 CFA-수지상 세포는 항원특이적 다기능 CD4+ T 세포의 증가 및 유지와 함께 동일 치료기간 내에 월등한 폐 조직 내 박테리아 수의 감소와 폐 염증의 현저한 감소를 유발함을 확인하였다. 또한, 재활성화 결핵 모델에서, 항생제와 함께 CFA-수지상 세포의 투여 한 그룹의 경우, 항생제 단독 투여 그룹에 비해 높은 수준의 센트럴 메모리 T 세포의 형성을 확인하였으며, 감염 후 35 주까지 결핵의 재 활성화로부터 높은 보호효과가 관찰되었다. 다제내성 결핵균 감염 마우스 모델에서도 CFA-수지상 세포에 의한 치료 효율 증가가 유지됨을 확인하여 결핵 억제의 주요 문제점 중 하나인 다제내성 결핵균의 치료 전략에 대한 적용 가능성을 확인하였다. 결론적으로, CFA- 수지상 세포를 통한 BCG 프라임-부스터 백신 및 항생제 치료에 대한 보조 면역요법은 기간 단축 및 결핵균 재 활성화 예방에 대한 수지상 세포 기반 면역 요법에 대한 새로운 가능성을 제시하였다. 종합적으로, 본 학위 논문에서는 (1) 결핵의 발병과 진행, 중증도에 관여하는 수지상 세포의 특징을 규명함은 물론, 병원성에 따라 형성되는 수지상 세포의 표현형적, 기능적 특성을 규명하였다. (2) 향상된 백신 개발을 위해 단백질 항원의 당화를 유도하여 비당화 항원 대비 향상된 백신효과를 확인함은 물론, 이를 식물 기반의 단백질 발현 시스템을 통하여 사용함으로써 추후 비용적 관리적 측면에서 효율적인 백신생산의 플랫폼에 대한 가능성을 제시하였다. (3) 수지상 세포의 직접적인 이용을 통하여 기존의 BCG 백신의 효율성 증대를 위해 BCG 프라임-부스터 백신 전략을 제시하였고, 수지상 세포 기반의 보조 면역치료(adjunctive immunotherapy)를 개발하여 새로운 결핵 치료요법의 전략을 제시하였으며, 결핵에 대한 예방 및 치료의 효율성 증대와 결핵의 재발에 대한 억제효과를 확인하였다. 본 학위논문에서 도출된 결과는 인류를 가장 괴롭혀 온 결핵을 효율적으로 제어하기 위하여 기초적 지식 발전뿐만 아니라 다양한 모델에서 실제로 적용가능성을 보여줌으로써 향후 개선 된 결핵백신 및 치료제 개발에 일조할 것이다. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is a harmful human pathogen causing 180 million annual deaths. To control this detrimental pathogen, a large amount of time and effort has been consumed but the mechanism of Mtb pathogenesis is still unclear. Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells mediating innate and acquired immunity. Acquired immunity, especially T cell immunity, is a crucial factor in controlling Mtb infection and disease, and DCs are an integral mediator of this process. Therefore, understanding the role of DCs in the pathogenesis of TB and their application in the development of treatments could provide a rational approach towards controlling TB. Chapter I contains a literature review regarding the role of dendritic cells in tuberculosis pathogenesis, the current status of TB vaccines used in clinical trials, and the application of DCs and their properties for development of TB vaccines. In Chapter II we demonstrate that Mtb infection inhibits optimal Th1 responses by altering the function of DCs. We infected DCs with either the virulent Mtb strain H37Rv or the attenuated strain H37Ra to investigate the phenotypic and functional alterations in DCs and the resultant T cell responses. H37Rv-infected DCs suppressed Th1 responses more strongly than H37Ra-infected DCs. Interestingly, H37Rv, but not H37Ra, impaired the expression of DC surface molecules (CD80, CD86, and MHC class II), due to prominent IL-10 production, while augmenting the expression of tolerogenic molecules, including PD-L1, CD103, Tim-3, and indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). These results indicate that virulent Mtb drives immature DCs toward a tolerogenic phenotype. Notably, the tolerogenic phenotype of H37Rv-infected DCs was blocked in DCs generated from IL-10-/- mice and in DCs treated with an IL-10-neutralizing monoclonal antibody (mAb), leading to restoration of Th1 polarization. These findings suggest that IL-10 induces a tolerogenic DC phenotype. Interestingly, p38 MAPK activation predominantly mediates IL-10 production; thus, H37Rv tends to induce a tolerogenic DC phenotype via expression of tolerogenic molecules in the p38 MAPK-IL-10 axis. Therefore, suppressing the tolerogenic cascade in DCs is a novel strategy for stimulating optimal protective T cell responses against Mtb infection. In Chapter III, we compared vaccine efficacy of non-glycosylated Ag85A (NG-Ag85A) expressed in Escherichia coli and glycosylated Ag85A (G-Ag85A) expressed in Nicotiana benthamiana. As a result, G-Ag85A induced a stronger IFN- response than NG-Ag85A in antigen-immunized mice, and the G-Ag85A-immunized group showed a greater protective efficacy on bacterial growth and histopathology at four and nine weeks post-infection. Importantly, the protective efficacy of G-AG85A immunization correlated with a remarkable generation of Ag-specific CD4+ T cells co-producing IFN-, TNF-, and IL-2. Taken together, these studies will provide new insights for the prevention and treatment of tuberculosis immunologically and may help develop new vaccines. In Chapter IV, we evaluated whether culture filtrate antigens (CFA)-pulsed-mature dendritic cells (DCs) vaccination could potentiate the efficacy of BCG vaccination as a booster vaccine and in therapy with anti-TB drugs in a murine model. We used various mouse models for aerosol infection with Mtb and transfer CFA-pulsed-matured DCs (CFA-DC) in order to evaluate the efficacy of CFA-DC as a BCG-booster vaccine or an immunotherapy with anti-TB drug treatment. Mice which received a BCG-prime/CFA-DC-boost vaccination promoted early recruitment of DCs and T cells in the mediastinal lymph node and lung. The CFA-DC-booster elicited a significant bacterial reduction from the early phase of infection along with remarkable generation of Ag-specific multifunctional CD4+ T cells co-producing TNF-, IFN- and IL-2. This regimen had protective efficacy against various clinical strains of Mtb, and had long-lasting protective efficacy until 26 weeks from boosting. In the case of chemotherapy experiments, CFA-DC transfer with antibiotics resulted in significant reduction in bacterial burden and lung inflammation accompanied by prominent maintenance of Ag-specific multifunctional CD4+ T cells. In addition, mice administrated antibiotics with CFA-DC transfer in a latent TB model were protected from Mtb-reactivation for up to 35 weeks post-infection. Finally, we confirmed the effect of CFA-DC on the treatment course of MDR-Mtb infection. Our results provide new insights into the BCG-booster vaccine, and into DC-based immunotherapy with respect to shortening antibiotic treatment duration and prevention of Mtb-reactivation. Taken together, these results provide evidence for mechanisms related to disease progression by identifying the immune response of Mtb infected dendritic cells and also pave the way for designing improved vaccines and therapy by using the properties of DCs against Mtb infection.