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Synergistic antitumor effect and mechanism of combined treatment with 17-DMAG and NVP-BEZ235 in Cisplatin-resistant human bladder cancer cells

Other Titles
 Cisplatin에 내성을 가지는 방광암 세포에서의 17-DMAG와 NVP-BEZ235의 항암효과 상승 작용 
Authors
 김형준 
College
 Graduate School, Yonsei University 
Department
 Dept. of Medicine 
Degree
박사
Issue Date
2020
Abstract
목적: 분자 샤페론 HSP90은 암세포 내에서 과도하게 발현되거나, 변이가 생긴 단백질을 보호하고 안정화시키는 기능을 가진다. 특히 종양유전자 단백질 (oncoprotein)을 비롯해 세포의 다양한 신호분자들을 조절하는 HSP90은 최근 여러 암종에서 이상적인 연구 타겟으로 지목되어 왔다. 이에 본 연구에서는 HSP90 차단제 17-DMAG와 PI3K/mTOR survival pathway 차단제인 NVP-BEZ235를 이용하여 cisplatin 내성 방광암 세포에서의 항암효과 상승 작용에 대하여 분석하였다. 대상 및 방법: Cisplatin에 내성을 가지는 세포주인 T24R2에 17-DMAG (2.5-20 nM)와 NVP-BEZ235 (0.5-4 uM)를 용량을 증가시키며, 단독, 혹은 복합 투여한 후 CCK-8 분석 및 clonogenic assay를 통해 두 약제간의 항암효과 상승 여부를 분석하였다. 또한 flow cytometry와 Western blot를 이용하여 두 약제간의 항암효과 상승 작용의 관련 기전에 대하여 분석하였다. 결과: Cisplatin에 높은 감수성을 가지는 T24와 내성 세포주인 T24R2 모두에서 17-DMAG의 우수한 dose- 및time-dependent한 항암효과를 볼 수 있었다. NVP-BEZ235 역시 두 세포 모두에서 dose- 및 time-dependent이긴 하나 제한적인 항암효과를 보였다. 두 약제를 1:200 fixed ratio로 복합 투여한 후 combination index를 이용하여, 분석한 결과 wide dose range에서 두 약제 간에 항암효과 상승작용이 존재함을 확인하였으며, clonogenic assay에서도 동일한 항암효과 상승작용이 확인되었다. 17-DMAG와 NVP-BEZ235의 항암효과 상승작용에 대한 3D 분석 결과 synergy volume은 201.84uM/ml2%로서 매우 우수한 상승 효과가 확인되었다. Flowcytometry 결과 T24R2 세포에서 두 약제의 복합 투여는 apoptosis 및 G1-phase cell cycle arrest를 유발하는 것으로 나타났으며 Western blot에서도 이와 동일한 caspases 활성의 증가 및 cyclin의 활성 억제가 확인되었다. 결론: 본 연구를 통하여 cisplatin에 내성을 가지는 방광암 세포주에서 17-DMAG의 단독 제제로서의 항암효과를 확인하였으며, 또한 PI3K/mTOR 차단제를 함께 처리하였을 때 apoptosis 및 G1-phase cell cycle arrest를 통해 우수한 항암효과 상승작용을 나타내는 것을 확인하였다. Purpose: The current study aimed to investigate the synergistic antitumor effect and mechanism of combined treatment with 17-DMAG (HSP90 inhibitor) and NVP-BEZ235 (PI3K/mTOR dual inhibitor) in the cisplatin-resistant human bladder cancer cell. Materials and Methods: A human bladder cancer cell line with cisplatin resistance (T24R2) was exposed to an escalating dose of 17-DMAG (2.5-20 nM) with or without NVP-BEZ236 (0.5-4 μM) in combination with cisplatin. Antitumor effects were determined by the CCK-8 analysis. Based on the dose-response study, synergistic interaction between two regimens was evaluated using a clonogenic assay and combination index. Flow cytometry and western blot were used to analyze the mechanism of synergism. Results: Dose- and the time-dependent antitumor effect of 17-DMAG was shown in both cisplatin-sensitive (T24) and cisplatin-resistant cell lines (T24R2). However, the antitumor effect of NVP-BEZ235 was found to be self-limiting. The combination of 17-DMAG and NVP-BEZ235 in a 1:200 fixed ratio showed a significant antitumor effect in cisplatin-resistant bladder cancer cells over a wide dose range, and clonogenic assay showed compatible results to synergy test. The three-dimensional analysis resulted in a strong synergy between two drugs with a synergy volume of 201.84 μM/ml2%. The combination therapy resulted in a G1-phase cell cycle arrest and caspase-dependent apoptosis confirmed by the western blot. Conclusion: HSP90 inhibitor monotherapy and in combination with PI3K/mTOR survival pathway inhibitor NVP-BEZ235 shows a synergistic antitumor effect in cisplatin-resistant bladder cancers through cell cycle arrest at the G1 phase and induction of caspase-dependent apoptotic pathway.
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 3. Dissertation
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/180922
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