The immunomodulatory effects of thalidomide and corticosteroid combinatorial treatment on T cell subsets and the identification of the molecular mechanisms

Abstract

장기 이식 이후에 나타나는 면역 거부 반응을 예방하거나 감소하는 것은 이식 분야에서 매우 중요한 문제이며, 면역 거부 반응 감소를 위해 사용되는 면역 억제제의 여러 부작용으로 인하여 면역 억제보다는 면역 조절의 필요성이 더욱 강조되고 있다. 면역 억제제 중의 하나인 dexamethasone (DX)과 입덧 치료제인 thalidomide (TM)의 병합 용법은 다발성 골수종 및 루푸스 신염과 같은 면역 관련 질환에 임상적으로 유의한 치료 효과를 보인다는 연구들이 보고 되었다. 하지만 아직까지 이에 대한 명확한 기전은 밝혀진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 TM과 DX 병합 처리에 의한 면역 조절 효과의 시너지를 확인하고, 약물 병합 처리 이후 T 세포 내의 co-stimulatory와 co-inhibitory 분자 발현 조절을 살펴봄으로써 약리 기전상의 target들을 탐색하고자 하였다. C57BL/6 생쥐 비장에서 미접촉 T 세포를 분리한 후, TM과 DX의 단독 또는 병합 처리 조건 하에서 효과 T 세포 증식 및 조절 T 세포 분화를 위해 배양하였다. 약물 처리 된 세포들을 수집하여 CD4+ T 세포 아형들에 미치는 변화들을 관찰하였고, 또한 유세포 분석을 통하여 증식 및 분화된 T 세포 내에서의 OX40, 4-1BB, glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor-related protein (GITR), cytotoxic T-lymphocyte–associated antigen 4 (CTLA-4), 및 programmed death 1 (PD-1) 분자 발현을 관찰 하였다. TM과 DX 단독 또는 병합 투여 된 C57BL/6 생쥐에서의 생체 내 비장의 CD4+ T 림프구 아형의 변화 역시 확인하였고, T 림프구 내에서의 CTLA-4와 PD-1의 발현, 그리고 비장 수지상 세포 내에서의 리간드 발현 또한 유세포 분석을 통하여 관찰 하였다. TM (1, 10 μM)은 농도가 증가할수록 CD4+ 효과 T 세포의 증식을 감소시켰으며, TM/DX (각각 1 또는 10 μM / 0.1 또는 1 nM) 병합 처리 조건에서는 더 효과적으로 증식을 감소시켰다. 조절 T 세포의 분화는 약물 처리 이후에 유의한 변화를 보이지는 않았다. 효과 T 세포의 co-stimulatory 분자 발현 역시 약물 병합 처리에 의하여 유의하게 감소하였고, 조절 T 세포 내의 분자 발현 또한 유의한 변화가 없었다. TM과 DX 단독 또는 병합 투여된 생쥐의 생체 내 효과와 T 세포 그리고 조절 T 세포의 변화는 체외 실험에서 관찰된 결과와 동일한 변화를 나타내었다. Co-inhibitory 분자 중 하나인 CTLA-4의 발현은 TM/DX 병합 처리 이후 체외 실험에서 조절 T 세포의 유의한 증가를 보였고, 생체 내 실험에서는 효과 T 세포 및 조절 T 세포 모두 유의하게 증가하였다. CTLA-4의 발현 증가와 상응하여 CTLA-4의 리간드인 CD80 과 CD86의 발현이 TM/DX 병합 처리 된 생쥐의 수지상 세포에서 유의하게 증가함을 확인 하였고, 수지상 세포의 면역 관용 특성에도 변화가 있음을 관찰하였다. 생체 내 외 결과 모두 TM/DX 병합 처리가 T 세포의 아형 별로 다르게 영향을 끼치는 것을 보여주고 있으며, 이러한 면역 조절 기능은 CD4+ T 세포와 수지상 세포 내에서 함께 신호전달 하는 분자들의 조절 기전을 통해 나타날 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구는 TM/DX 병합 처리 치료를 이식 후 관용적 면역 상태 또는 면역 항상성 유지를 위한 효과적인 면역 조절 방법으로 제안한다. Reducing or preventing allograft rejection is a critical issue in organ transplantation, and the need for immune modulation rather than immune suppression has been emphasized. Many studies have reported combinatorial therapies of thalidomide (TM) and dexamethasone (DX) can be used clinically for immune-related diseases, such as multiple myeloma and lupus nephritis, but the mechanism responsible for its effects has not been elucidated. In this study, we suggest that TM and DX combinatorial treatment induces an enhanced immunomodulatory effects on T cells through regulating expression of co-stimulatory and co-inhibitory molecules. Splenic naïve T cells from C57BL/6 mice were sort-purified and cultured for CD4+T cell proliferation and regulatory T cell (Treg) conversion in the presence of TM and/or DX. Following incubation with the drugs, cells were collected and population changes in each T lymphocyte subset were examined. The expression of OX40, 4-1BB, glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor-related protein (GITR), cytotoxic T-lymphocyte–associated antigen 4 (CTLA-4), and programmed death 1 (PD-1) in proliferated and converted T cells was also quantified by flow cytometry. In vivo Splenic T lymphocyte subsets in normal C57BL/6 mice treated with TM and/or DX administration were also examined. Moreover, the expression of CTLA-4 and PD-1 on splenic CD4+ T cells and the expression of respective ligands on splenic dendritic cells (DCs) isolated from TM- and/or DX-treated mice were observed and quantified by flow cytometry. TM (1 or 10 µM) decreased CD4+T cell proliferation in a dose-dependent manner, while TM/DX (1 or 10 µM/0.1 or 1 nM, respectively) combinatorial treatment further decreased proliferation. Treg populations were preserved following drug treatment. Furthermore, the expression of co-stimulatory molecules decreased upon TM/DX combinatorial treatment in effector T cells (Teffs) and was preserved in Tregs. Splenic CD4+T cells isolated from TM- and DX-treated mice exhibited the same patterns of Teff and Treg populations as observed in vitro. The expression of CTLA-4, a co-inhibitory molecule, on Tregs significantly increased in vitro, as did that of CTLA-4 on Tregs and effector T cells in vivo with TM/DX combinatorial treatment. Corresponding to increased CTLA-4 expression in T cells, the expression of CD80 and CD86 (ligands for CTLA-4) significantly increased in splenic DCs in TM/DX-treated groups. Moreover, changes in tolerogenic properties of DCs were also observed upon TM/DX administration. Considering the selective effects of TM/DX combinatorial treatment on different T cell subsets, TM/DX combinatorial treatment possesses systemic immunomodulatory effects in regulating the expression of co-stimulatory and/or co-inhibitory molecules in CD4+T cells and DCs. In conclusion, we suggest that TM/DX combinatorial treatments are efficient immunomodulatory methods that exhibit promising capacity for maintaining a tolerogenic state or immune homeostasis.