KLHL4, a novel p53 target gene, inhibits cell proliferation by activating p21WAF/CDKN1A

Abstract

KLHL4 is a member of the KLHL protein family. Some of the KLHL proteins were shown to bind to the Cul3 E3 ligase and are involved in ubiquitination of their interacting proteins. KLHL4 gene localized on the X chromosome is associated with an X-linked cleft palate (CPX) disorder. The biological functions of KLHL4 is largely unknown. Microarray analysis of HEK293A cells overexpressing p53 showed 3 fold of increase of KLHL4 mRNA expression. We also found that ectopic p53 increases KLHL4 expression at mRNA and protein levels. Moreover, KLHL4 expression is significantly induced by etoposide treatment. All these data suggest that p53 increases KLHL4 expression. Furthermore, KLHL4 activates expression of p21WAF/CDKN1A, a p53 target gene and negative regulator of cell cycle. KLHL4 increases p21 promoter activity of transcription through p53 response elements. KLHL4 does not directly bind to the p53 response element of p21WAF / CDKN1A, but KLHL4 upregulates p21WAF/CDKN1A in transcription level through an increase in p53 binding to distal p53 response elements, p53RE2. As a result, KLHL4 decreases cell proliferation in HEK293A cells. Also, KLHL4 interacts with Cul3, and may act as an adaptor protein in ubiquitin ligase complexes. More experiments should be done to find the substrate of KLHL4. KLHL4 KO mouse embryonic fibroblast (MEF) cells showed decrease in p21 expression and faster cell growth than the WT MEF cells. These results suggest that KLHL4 induced by p53 may act as a potential tumor-suppressor by increasing p21WAF/CDKN1A.

KLHL4는 KLHL 단백질 계열의 구성원으로, 일부 KLHL 단백질은 Cul3 E3 ubiquitin ligase complex와 결합하여 유비퀴틴화에 관여하는 것으로 알려져 있다. X 염색체 상에 위치한 KLHL4 유전자는 CPX 장애와 관련이 있다고 보고 되었지만 생물학적 기능은 알려지지 않았다. p53을 과발현시킨 HEK293A 세포의 microarray 분석 결과 KLHL4 mRNA가 대조군 대비 3 배 가량 증가하는 것을 보였다. 이를 토대로 p53이 KLHL4의 mRNA및 단백질의 발현을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 또한, KLHL4 발현은 etoposide 처리에 의해 유도된 p53에 의해 증가하였다. 이러한 데이터는 p53이 KLHL4 발현을 조절할 수 있음을 시사한다. KLHL4가 p53 pathway에서 어떠한 역할을 가지는지 조사하였다. KLHL4는 p53 표적 유전자 중 하나이며, 세포주기 진행의 억제자인 p21WAF/CDKN1A 발현을 증가시킨다 KLHL4는 p21WAF / CDKN1A 유전자의 p53 결합 부위에 직접적으로 결합하지 않고, p53 결합을 증가시킴으로써 전사 수준에서 p21WAF / CDKN1A의 전사를 증가시킨다. 이러한 현상은 p53 단독 과발현보다 KLHL4와 p53을 함께 과 발현시켰을 때 p21의 프로모터 활성이 더욱 증가되는 것을 통해 알 수 있다. KLHL4는 HEK293A 세포에서 p21WAF / CDKN1A 발현 증가를 통한 세포 증식을 감소시킨다. 또한, KLHL4는 Cul3와 결합하며, ubiquitin ligase complex에서 어댑터 단백질로써 작용할 수 있다. 따라서 KLHL4의 기질을 찾기 위한 여러 실험들이 진행되어야 한다. KLHL4 유전자 Knockout 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF)는 정상 MEF 세포보다 p21 발현이 감소되어 있고 세포의 성장이 빨랐다. 이러한 결과는 p53에 의해 유도 된 KLHL4가 p21WAF / CDKN1A를 증가시킴으로써 나타나며, KLHL4가 종양 억제인자로 작용할 수 있음을 시사한다.