Genotype-phenotype correlations of the mitochondrial DNA mutations in Leigh syndrome

Abstract

리이 증후군은 소아기의 미토콘드리아 질환의 가장 흔한 질환군이다. 리이 증후군은 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군과 핵유전자 연관-리이 증후군으로 나뉘는데, 이 둘은 유전형, 임상증상 등에서 큰 차이를 보인다고 알려져있다. 그 중에서, 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군은 돌연변이 유전형 그 자체 뿐만 아니라, 이종조직성을 고려해야하기 때문에 연구에 어려움이 있다. 우리는 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군에서 돌연변이 부하를 고려하여 유전형-표현형 연관분석을 시행하였다. 우리는 한국의 한 3차 의료기관에서, 임상적으로 리이 증후군으로 진단된 환자 130명에게 차세대 염기서열 분석 기술을 이용하여 전체 미토콘드리아 DNA 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과 27명의 환자들이 유전적으로 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군으로 진단되었으며, 이들에게 돌연변이 부하를 조사하였다. 또한, 임상적인 특징, 실험실 데이터, 뇌영상들 그리고 장기간 추적검사 데이터를 정리하여 돌연변이 부하와 연관분석을 하였다. 이를 위해서 우리는 데이터 시각화 방법을 이용하여 데이터 패턴을 분석하였다. 전체 미토콘드리아 DNA 염기 서열 분석 후, 돌연변이 유전자가 확인된 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군은 6개의 유전자형, 그리고 10개의 미토콘드리아 DNA 뉴클레오타이드 변이로 분류될 수 있었다. 그 중, 세 가지 주요 유전자의 돌연변이에서 돌연변이 부하 분포의 차이는 통계적으로 유의하게 차이가 있었다. MTATP6 유전자는 상대적으로 높은 돌연변이 부하를 보인 반면, MT-ND5 유전자는 상대적으로 낮은 돌연변이 부하를 보였다. 다른 유전형과 비교하여 MT-ATP6 유전자는 돌연변이 부하가 훨씬 높고, 여러가지 장기에 침범하는 양상을 보였다. MT-ND3는 뇌전증과 매우 밀접한 관계가 있다고 생각되며, 관련 병리학적 뉴클레오타이드 변화로는 m.10191T>C 가 관찰되었다. 호흡 보조제, 산소 의존성 및 장 튜브와 같은 지지 치료의 필요성은 다른 유전자형보다 MT-ND3 유전자 돌연변이 환자에게서 더 높았다. MT-ND5 유전자 (m.13513G>A)의 돌연변이를 가진 환자에서 75% (n =3)의 특징적인 심장 관련 침범이 관찰되었는데 이는 MT-ATP6 돌연변이에서 심장 관련 침범이 발견되지 않은 것과는 대조적이다. 결론적으로 우리는 이전의 여러 연구에서 발견되지 않은 미토콘드리아 DNA 연관-리이 증후군의 특징을 발견했다. 첫째, 돌연변이 부하의 분포는 유전자에 따라 다르므로 동일한 유전자 또는 동일한 뉴클레오타이드 변화에 대해 충분한 환자를 수집하면 더욱 구체적이고 일반적인 결론을 내릴 수 있다고 생각된다. 둘째, 미토콘드리아 유전형과 뉴클레오타이드의 병리학적 변이가 미토콘드리아 DNA의 일부 표현형과 관련이 있는 것으로 관찰되었다. 통계 분석의 어려움에도 불구하고 이것은 기존의 질적 분석 방법의 유전자형 - 표현형 상관 관계보다 한 걸음 더 나아간 연구이며, 이 연구는 궁극적으로 리 증후군의 임상 결과의 해석, 유전 상담 및 유전자 표적 치료를 위한 기초를 제공할 것으로 기대된다.

Leigh syndrome is the most common clinical presentation of mitochondrial diseases in children and is genetically divided into mitochondrial DNA (mtDNA)-associated Leigh syndrome and nuclear gene-encoded Leigh syndrome, both of which differ in genotypes, prevalence and clinical features. The mtDNA-associated Leigh syndrome is influenced not only by the pathogenicity of the mutant gene itself, but also by the relative amounts of mutant and wild-type mtDNA, heteroplasmic mutant load. We aim to investigate the genotype-phenotype correlations by a quantitative analysis of heteroplasmic mutant load and subgrouping of genotypes in genetically confirmed patients with mtDNA-associated Leigh syndrome. We performed whole mitochondrial DNA sequencing with next generation sequencing (NGS) technology on 130 patients clinically diagnosed with Leigh syndrome in a single tertiary medical institution in Korea. As a result, mtDNA mutations were detected in 31 patients with clinical Leigh syndrome. However, four of them were excluded from this study because they had currently unverified variants in the academic literature. Finally, 27 patients with Leigh syndrome were identified as having Leigh syndrome with mtDNA mutation. The patients with genetically confirmed Leigh syndrome with mtDNA mutations were additionally tested for mutant load by NGS. We reviewed the clinical manifestations of the patients included in this study with reference to stringent diagnostic criteria for clinical diagnosis of Leigh syndrome. Laboratory findings, brain imaging (MRI, MRS) and data from long-term follow-ups are investigated for phenotype analysis. In order to investigate the relationship between genotypes and various phenotypes around mutant loads, we tried to understand patterns and relationships through scatter plots and bar-plots for data visualization. The first symptom of the patients was developmental delay or declining, which accounted for the majority of the whole (48.1%), followed by seizure (11.1%), ataxia (11.1%), hypotonia (11.1%), visual disturbance (11.1%) and gait disturbance (7.4%). Basal ganglia involvement was found in all patients regardless of the pathologic genotype or nucleotide change, and high involvement was observed in the brain stem (N = 18, 66.7%), followed by involvement of the thalamus (N = 14, 51.9%), cerebral atrophy (N = 14, 51.9%) and cerebellar atrophy (N = 12, 44.4%). The median year from diagnosis of Leigh syndrome to last follow-up was 5.4 years (ranged from 0.1 to 12.1 years). Nine patients received respiratory support (33.3%) and 10 patients deteriorated with oxygen dependence (37.0%). Nine patients (33.3%) were assisted by enteral tube feeding. After whole mtDNA sequencing, gene confirmed mtDNA Leigh syndrome could be classified as 6 genotypes or 10 mtDNA nucleotide changes. The range of mutant load of the patients ranged from 55.5 to 100%, and the median value was 96.3%. The difference of distribution of the mutant load of these three major genes was statistically significant. MT-ATP6 showed a relatively high mutant load, while MT-ND5 had a relatively low mutant load. Compared with other genotypes, the MT-ATP6 gene has a significantly higher amount of mutant load, a wider organ involvement status, and a greater number of first symptoms. In particular, MT-ND3 is thought to have a very strong association with epilepsy, and related pathologic nucleotide changes are noted as m.10191T>C. The need for supportive equipment, such as respiratory supports, oxygen dependency and enteral tubes, also were greater in MT-ND3 than other genotypes. In patients with a mutation of the MT-ND5 gene (m.13513G> A), a characteristic cardiologic involvement of 75% was observed (N = 3), which is in contrast to the absence of cardiac involvement in MT-ATP6. In conclusion, we found features of mtDNA Leigh syndrome that were not found in several previous studies. First, the distributions of heteroplasmic mutant loads vary according to the gene, so if we collect enough patients for the same gene or the same nucleotide change, we can conclude a more specific and general conclusion. Second, pathologic variants of mitochondrial genotypes and their associated pathologic nucleotide changes have newly been found to be associated with some phenotypes of mtDNA associated with Leigh syndrome. Even with the difficulty of statistical analysis, this is a further step forward than the previous genotype-phenotype correlation of existing qualitative analysis, and this study would ultimately provide a good basis for interpretation of clinical results, genetic counseling and genetic targeted therapy of Leigh syndrome.