(The) effect of small G protein signaling modulator 3 for hypoxic cardiomyocytes

Abstract

Connexin 43 (Cx43), a ubiquitous connexin expressed in the heart and skin, is associated with a variety of hereditary conditions. Therefore, the characterization of Cx43-interacting proteins and their dynamics is important to understand not only the molecular mechanisms underlying pathological malfunction of gap junction-mediated intercellular communication but also to identify novel and unanticipated biological functions of Cx43. In the present study, we observed potential targets of Cx43 to determine new molecular functions in cardio-protection. MALDI-TOF mass spectrometry analysis of Cx43 co-immunoprecipitated proteins showed that Cx43 interacts with several proteins related to metabolism. In GeneMANIA network analysis, SGSM3, which has not been previously associated with Cx43, was highly correlated with Cx43 in heart functions, and high levels of SGSM3 appeared to induce the turnover of Cx43 through lysosomal degradation in myocardial infarcted rat hearts. Moreover, we confirmed that lysosomal degradation of Cx43 is dependent upon the interaction between SGSM3 and Cx43 in H9c2 cardiomyocytes. Additionally, we investigated the protective effects of kenpaullone on cardiomyocytes following H2O2-induced oxidative stress mediated by the interaction of SGSM3 with Cx43. We found that the gap junction protein Cx43 was significantly down-regulated in an H2O2 concentration-dependent manner, whereas expression of SGSM3 was up-regulated upon H2O2 exposure in H9c2 cells. The effect of kenpaullone pretreatment on H2O2-induced cytotoxicity was evaluated in H9c2 cells. H2O2 markedly increased the release of lactate dehydrogenase (LDH), while kenpaullone pretreatment suppressed LDH release in H9c2 cells. The functional importance of the interaction between SGSM3 and Cx43 was confirmed by results showing that Cx43 expression was enhanced by SGSM3 siRNA knockdown in H9c2 cells. Moreover, kenpaullone pretreatment significantly reduced ROS fluorescence intensity and significantly down-regulated the level of apoptosis-activating genes (cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 and cytochrome C), autophagy markers (LC3A/B), and the Cx43-interacting partner SGSM3. In summary, the results of this study elucidate the molecular mechanisms in which Cx43 with SGSM3 is degraded in myocardial infarcted rat hearts, which may contribute to the establishment of new therapeutic targets to modulate cardiac function in physiological and pathological conditions. In addition, kenpaullone plays a role in protecting cardiomyocytes from oxidative stress and that the turnover of Cx43 through SGSM3-induced lysosomal degradation underlies the anti-apoptotic effect of kenpaullone.

심장 및 피부조직에서 발현되는 연결 인자 인 Connexin 43 (Cx43)은 다양한 유전적 조건과 관련이 있다고 잘 알려져 있다. 따라서 Cx43와 상호 작용하는 단백질을 찾아내고 동역학을 이 해하는 것은 gap junction이 매개하는 세포 간 교통의 병적 부 전 원리뿐만 아니라 Cx43의 알려지지 않은 생물학적 기능을 확인하는 데 중요하다. 본 연구에서는 심장 보호에서 관여하는 새로운 분자 기능을 결정하는 Cx43의 잠재적 표적을 관찰했다. 공면역 단백 침전법(co-immunoprecipitated)을 통한 MALDI-TOF 질량 분석결과 Cx 43과 상호작용하는 몇몇 단백질을 찾았다. GeneMANIA 네트워크 분석에서, 이전에 Cx43과 관련성이 밝혀지지 않은 SGSM3가 심장 기능에서 Cx43와 높은 상관 관 계가 있었으며 SGSM3의 증가는 심근 경색된 쥐 심근 세포에서 리소좀 분해를 통한 Cx43의 분해를 유도하는 것으로 나타났다. Cx43의 분해는 H9c2 심근 세포에서도 SGSM3와 Cx43사이의 상호 작용에 의존하는 것을 확인했다. 또한 H2O2에 의해 유도 된 산화 스트레스 조건에서 SGSM3와 Cx43의 상호 작용과 관 련하여 kenpaullone의 보호 효과도 조사했다. 먼저H9c2 세포 에서 Cx 43이 H2O2 농도에 따라 유의하게 하향 조절되는 반면, SGSM3의 발현은 H2O2농도에 따라 상향 조절된다는 것을 발견했다. H2O유도 된 세포 독성에 kenpaullone 전처리의 영향을 H9c2 세포에서 평가하였다. H2O2는 lactate dehydrogenase (LDH)의 방출을 현저히 증가 시켰고, kenpaullone 전처리는 H9c2 세포에서 LDH 방출을 억제했다. SGSM3과 Cx43 사이의 상호 작용의 기능적 중요성은 Cx43 발현이 H9c2 세포에서 SGSM3 siRNA knock down에 의해 강화되는 결과로 확인되었다. 또한 ke npaullone 전처리는 apoptosis 활성화 유전자 (cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 및 cytochrome C), autophagy marker(LC3A / B) 및 Cx43 상호 작용 파트너인 SGSM3를 의미있게 억제하였다. 결론적으로, SGSM3는 심근경색 모델에서 Cx43의 상호작용 파트너로 확인되었으며 향후 새로운 치료 표적의 수립에 기여할 것으로 보인다. 또한 kenpaullone은 SGSM3에 의한 Cx43분해에 관여하여 산화 스트레스 심근 세포로부터 보호하는 역할을 한다.