Preconditioning of SIRT1 activator improves chondrogenic differentiation potential of mesenchymal stem cell

Abstract

골 관절염은 퇴행성 관절 관련 질병으로, 이는 연골 재생 능력이 부족하여 점진적으로 광범위한 연골 손상이 발생하게 된다. 골 관절염의 주요한 세포 병리학적 현상은 연골의 손상, 연골세포 증식 문제, 그리고 연골의 비대화이다. 현재, 이를 치료하기 위한 여러 가지 연골 재생 치료 방법이 진행되고 있는데, 여러 가지 방법 중 세포 치료제가 최근 주목 받고 있다. 세포 치료제 중 특히 중간엽 줄기 세포를 이용한 방법이 가장 널리 이용되고 있다. 중간엽 줄기 세포를 세포 치료제로 이용하기 위해서는 부족한 세포를 증식하기 위한 체외 배양이 필수적이다. 또한 세포 치료제로써의 유효량을 얻기 위해서는 체외에서 장기간 배양이 불가피하다. 체외에서 장기 배양 시, 중간엽 줄기 세포는 자가 증식력과 다분화능을 잃게 되며 또한 연골로 분화 시 연골의 비대화가 유발되게 된다. 이와 같은 문제점을 극복하여 중간엽 줄기 세포의 줄기 세포능과 연골 분화능을 향상시키기 위한 새로운 전략이 필요하다. Resveratrol은 강력한 SIRT1 활성제로, 중간엽 줄기 세포에서 세포의 생존, 증식력 그리고 다분화능에서 주요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이전 연구에 따르면, SIRT1의 발현이 유지되고 있는 초기 계대의 중간엽 줄기 세포에 resveratrol을 처리하였을 경우, 중간엽 줄기 세포의 자가 증식력, 골 분화능 그리고 지방세포 분화능이 후기 계대가 되어도 초기 계대와 유사하게 유지 되는 것을 알 수 있었다. 하지만 이 때, resveratrol을 초기 계대부터 지속적으로 처리하였을 경우 연골세포로의 분화능은 검증 되지 않았다. 본 연구에서는 resveratrol을 1 계대의 중간엽 줄기 세포부터 지속적으로 처리하면서 배양하였을 경우 중간엽 줄기 세포의 증진된 연골 세포 분화능을 검증하였다. 따라서, 중간엽 줄기 세포를 micromass culture 방법을 이용하여 연골 분화를 유도 하여 real-time PCR과 western blot을 통하여 연골 분화 마커의 발현을 비교하였다. 그 결과, resveratrol을 처리해 주었을 경우에 더 높은 연골 분화능을 유지하고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 염색 및 면역 염색법을 이용하여 분화된 세포의 GAGs와 PGs 가 형성된 정도를 확인하고 연골 분화 마커의 발현을 면역 염색법을 이용하여 확인하였다. 또한 연골 세포로 분화되었는지 확인하기 위하여 연골 비대화 관련 마커를 real-time PCR과 western blot을 이용하여 확인한 결과, resveratrol을 처리한 중간엽 줄기 세포에서는 연골 비대화가 감소되어 있는 것을 알 수 있었다. 이어서 체내 연골 재생능을 검증하기 위하여 토끼의 골연골 결손 모델을 확립하여, 결손 부위에 세포를 이식하였다. 그 결과를 조직학적 분석을 통하여 확인을 하였다. Resveratrol을 처리한 중간엽 줄기 세포는Safranin O/ Fast green stain을 통하여 형성된 GAG를 확인할 수 있었고, HE stain을 통해서 온전한 연골 세포가 형성 된 것을 확인하였으며, MT stain을 통하여 교원질 증착을 확인 할 수 있었다. 그리고 연골이 재생되었는지 확인하기 위해, 연골 분화 마커와 비대화 마커를 면역 염색법을 이용하여 발현 정도를 확인 결과 resveratrol을 처리한 중간엽 줄기 세포가 연골 분화 마커는 증가 되었지만 반대로 비대화 마커는 감소된 것을 알 수 있었다. 요약하면, resveratrol을 SIRT1이 발현되고 있는 1 계대의 중간엽 줄기 세포부터 지속적으로 처리를 하게 되면, 세포 치료제로 주로 이용하는 5계대인 중간엽 줄기 세포의 줄기 세포능과 분화능이 passage 1과 유사하게 유지하게 됨으로써, 연골 분화능이 증진됨과 동시에 비대화를 억제하는 것을 체외와 체내 실험을 통해 알 수 있었다. 이와 같이 resveratrol을 지속적으로 처리해 함으로써 세포의 치료적 유효량을 더욱 빨리 획득이 가능하며 더불어 더욱 효율적인 연골 분화가 가능한 점에서 골관절염의 효과적인 세포 치료제로써의 역할을 할 것으로 사료된다.