Evaluation of hypoxic PET radiotracer in xenograft murine model after anti-angiogenesis treatment

Abstract

목적: 종양 저산소증은 고형암의 증식과 전이과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 종양 저산소증은 방사선치료와 항암요법 등과 같은 암 치료에 대해 높은 저항을 나타낼 뿐 아니라 종양의 악성도를 증가시키며 신생혈관 생성을 유도하고, 전이 발생을 증가시킨다고 알려져 있다. 그러므로 종양 저산소상태의 비침습적 확인은 종양의 악성도를 예측하고 치료계획을 세우기 위해 중요하며 암환자의 생존율 또한 저산소증에 지대한 영향을 받기 때문에 종양에서의 저산소증에 대한 연구와 영상을 이용한 탐지 방법은 근래 들어 광범위하게 연구되고 있다. 18F-Fluoromisonidazole (18F-MISO)와 64Cu-diacetyl-di(N4- methylthiosemicarbazone) (64Cu-ATSM)을 이용하여 양전자 방출 단층 촬영(Positron Emission Tomography, PET)으로 저산소 상태를 평가할 수 있고 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG)은 세포의 당 대사 추적자로 종양의 저산소증과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 이 연구의 목적은 이종이식 쥐에서 항혈관형성제제의 치료효과 평가하는데 있어서 18F-MISO, 64Cu-ATSM, 18F-FDG PET추적자들의 역할을 보고자 한다. 방법: 인간 대장암세포주인 HCT116을 1% O2 저산소실이나 정상산소 배양실에 3시간과 15시간 배양한 후에 18F-FDG, 18F-MISO, 64Cu-ATSM을 넣고 방사선 섭취량을 측정하였다. 웨스턴블롯 분석 기법을 이용하여 HIF1a, GLUT-1의 발현 정도를 분석하였다. 추가적으로 세포외액의 환경에 따른 18F-MISO 섭취 영향을 평가하기 위하여 산성 세포배액에 같은 실험을 반복하였다. 그리고, 괴사한 세포에서 18F-MISO의 섭취 여부를 평가 하기 위하여 HCT116을 고열(55oC)를 유도하여 18F-MISO 섭취 실험하고, 장기간 저산소실에 보관하고 괴사를 유도한 후 같은 18F-MISO 실험을 반복하였다. 동물실험에서 항혈관형성제제인 Avastin의 치료 효과 평가하기 위하여 HCT116을 마우스 오른 뒷다리에 심었으며, 치료 전날 18F-FDG PET 끝난 후, 그 다음 날 18F-MISO이나 64Cu-ATSM PET을 치료 당일 날에 시행하였다. PET 촬영한 직후 Avastin 치료 시작하였으며 2주간 치료하였다. 치료 후 18F-FDG/18F-MISO 나 18F-FDG/64Cu-ATSM 조합으로 PET을 촬영하였다. PET촬영 직후 마우스를 희생하여, 종양을 적출하였다. 종양 조직의 반은 포르말린에 담궈 면역염색 (pimonidazole, H&E, Ki-67) 진행하였고, 종양 조직의 남은 반은 cryosection하여 자가조직방사선촬영을 진행하였다. 결과: 세포실험에서 HCT116은 18F-MISO이나 64Cu-ATSM 방사선추적자들이 18F-FDG에 비해 저산소증환경에서 높은 섭취를 보였다. 웨스턴블롯 결과에서 HIF1a이 저산소증환경에서 안정화되었음을 확인하였으나 GLUT1 발현은 크게 일어나지 않았다. 산성환경 (pH 6.9)에서 18F-MISO 섭취가 50% 감소한 것을 확인하였고, 18F-MISO이 괴사조건에서 정상산소환경보다 섭취 많은 것을 확인하였으나, 저산소환경 만큼 섭취되지 않았다. 동물연구에서 아바스틴 치료한 마우스에 심은 종양이 대조군에 비해 천천히 자랐으며, 면역염색결과에서 저산소 영역이 치료군에서 더 많았다 (17.67% ± 5.95 vs 11.02 ±4.81, p=0.004). 이에 반해 Ki67이나 괴사정도는 차이가 나지 않았다(36.02±24.8 vs27.82±14.0, p=0.249). 또한, 치료 후 PET에서 치료군이나 대조군에서 방사선 섭취량의 차이는 현저한 차이를 보이지 않았다 (18F-FDG: 5.4±6.4, 3.0±1.8, p=0.123; 18F-MISO: 4.6±3.0 vs 4.6±2.7, p=0.953). 자가조직방사선촬영 분석에서는 괴사된 부분에서 18F-MISO 섭취가(2.41±1.77) 18F-FDG이나 (0.83±0.42, p=0.001) 64Cu-ATSM 보다(0.94±0.48, p=0.005) 현저히 많았다. 결론: HCT116 대장암 피하조직 동물모델에서 아바스틴 치료 2주 후 종양증식억제가 관찰되었으며, 저산소범위가 증가되었다. 괴사 조직 평가 위하여 64Cu-ATSM가 18F-MISO보다 종양의 조직괴사 부분을 더 잘 반영하였다.