Axon generation and myelination in motor neuron-Schwann cell coculture model

Abstract

Myelination in the nervous system is an important structural element to electrically insulate the axon for the propagation of action potential with increased conduction velocity. In the peripheral nervous system (PNS), each Schwann cell corresponds with one internode in myelin sheath that is essential for the maintenance of propriety and functions of peripheral nerves. However, the deficiency of peripheral nerves in both disease and injury model still remains unsolved and studies to recover this limitation have been performed in vivo as well as in vitro. Here, we successfully constructed 2-D and 3-D models of the motor nervous system. We first constructed 2-D MN-SC coculture on coverslip to understand interactions between MNs and SCs, and then developed 3-D MN-SC coculture model on the microfluidic biochips to recapitulate in vivo conditions. MN is reportedly difficult to culture for more than a week. However, MNs were well-maintained in our coculture model for more than a mo. During this time, SCs not only supported the survival of motor neuron but also promoted the outgrowth of axons. This effect was found to arise from the SC-secreted progranulin (PGRN) and the secretion of this protein was regulated by SC proliferation. We found that PGRN and their fragments, GRN C and GRN E, function as strong neurotrophic factors, enabling the viability of MNs for more than two weeks in MN culture without SCs. Furthermore, we found that the axon outgrowth could be promoted by optogenetic stimulation with a dramatic effect in MN monocultures. Furthermore, SC is a structurally important cell source, which forms myelin. We performed temporal quantitative measurement of SC in the coculture model and found the effect of coenzyme Q10 on the myelination promotion. These findings provide a very useful tool to enable us to break through the limitations in motor nervous system research. Our results might help to decipher the myelination mechanism and learn more about MN diseases such as ALS, through drug screening. Furthermore, this in vivo mimicking in vitro model, might help in the study of post-injury mechanisms in greater detail by overcoming the limitations in the field of regeneration.

신경시스템에서 수초의 형성은 축삭 주위를 둘러싸고 있는 중요한 구조로 수초형성에 의해 빠른 신경도약을 가능하게 하는 절연체이다. 중추신경계에서는 희돌기신경교, 말초신경계에서는 슈반세포가 축삭 주위를 감싸는데, 중추신경계의 희돌기신경교는 세포질을 이용하여 여러 신경세포의 축삭을 둘러쌓는 반면, 말초신경계의 슈반세포는 세포체 전체가 하나의 슈반세포가 하나의 신경세포 축삭의 일부분을 감싸고 있는 차이가 있다. 이러한 신경계에서 손상을 받으면 지금까지는 중추신경계에서는 재생이 불가능하고 말초신경계에서는 손상 후 재생이 이루어 진다고 보고 되어 왔지만 이러한 말초신경계의 재생도 환자의 나이, 손상의 정도, 재생의 환경에 의해 크게 좌우된다. 많은 문헌에서는 손상모델 뿐만 아니라 질환모델에서 신경재생을 위한 연구를 진행하고 있지만 아직까지 명확하게 해결책을 찾지 못했고, 여러가지 재생의 한계점을 풀지 못했다. 이 논문에서는 이러한 한계점을 극복하기 위해 신경계 중 움직임을 조절하는 운동신경계의 이차원적과 삼차원적인 in vitro 모델을 확립하고 여기에 축삭의 성장과 수초형셩을 촉진시키는 요인을 연구하고자 한다. 먼저, 이차원적 운동신경모델의 형성으로 운동신경과 슈반세포의 상호작용을 이해하고 그 다음 microfluidic 바이오칩을 이용하여 삼차원적인 in vitro모델 형성으로 in vivo와 유사한 환경을 재현하였다. 지금까지 알려진 운동신경은 배양했을 때 일주일 이상 그 생존율을 지속하기 어렵다. 하지만 슈반세포와의 공동배양을 통해 운동신경의 생존율은 한 달간 지속 되었다. 이 기간 동안 슈반세포는 운동신경의 생존 뿐만 아니라 축삭의 성장까지 증가시켰다. 이러한 슈반세포의 효과는 슈반세포에서 분비하는 7.5개의 granulins (GRN) 로 이루어진Progranulin (PGRN)이라는 단백질에 의해서 조절되고그 중 GRN C와 E 가 강력한 neurotrophic 요소로서 슈반세포가 없는 상태에서 운동신경세포의 생존을 이주 이상 지속시켰다. 또한 우리는 광유전자를 이용하여 운동신경 축삭의 성장을 촉진시키는데 그 방법을 확립하였다. 게다가 슈반세포는 수초를 형성하는 중요한 세포로서 이 논문에서는 슈반세포의 수초형성 과정을 정량적으로 측정하였고 이 공동배양 모델을 통해coenzyme Q10이 수초형성을 촉진시키는 약물인 점을 확인 할 수 있었다. 이러한 공동배양 모델은 앞에서 언급한 운동신경 재생의 한계점을 극복하는데 중요한 도구로 사용 될 수 있다. 또한 수초형성 메카니즘을 분석하고고ALS와 같은 운동신경 질환을 연구하는데 약물 스크리닝을 할 수 있는 도구로서도 도움을 준다. 그 뿐만 아니라 in vivo 모사in vitro 모델은, 손상 후 재생의 한계점을 밝혀혀 세포간의 정밀한 메카니즘을 연구하는데 용이하다./