S267F variant of sodium taurocholate cotransporting polypeptide and its clinical association in Korean patients with chronic hepatitis B

Abstract

Background: Sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) was recently identified as a cellular receptor for hepatitis B virus (HBV). The substitution of serine residue at position 267 of NTCP with a phenylalanine residue (S267F) is an Asian-specific variation that hampers HBV entry in vitro. In this study, we aimed to evaluate the prevalence of S267F polymorphism in Korean patients with chronic hepatitis B (CHB) and its association with disease progression. We also investigated whether bile acids affect the entry of HBV in vitro. Methods: The effect of S267F variant on HBV infection was assessed using mutagenesis, transfection, virus inoculation and ELISA. For HBV preparation, HepAD38 cell line was used. The presence of S267F polymorphism was assessed in 1,200 patients with CHB and 176 individuals seronegative for hepatitis B surface antigen (HBsAg). Genomic DNA was extracted from whole blood and the S267F polymorphism was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The association between S267F mutation and its clinical association was also analyzed. Results: In vitro investigation using HepG2-NTCP cell line revealed that the S267F variant of NTCP reduced HBV infection and appears to compete with ursodeoxycholic acid for the NTCP receptor. The frequency of the S267F variant (genotype CT or TT) in Korean CHB patients and HBsAg-seronegative individuals was 2.7% and 5.7% (P=0.031), respectively, and those who had S267F variant were less susceptible to HBV infection. The frequencies of the S267F variant in CHB, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC) patients were 3.3%, 0.9%, and 3.5%, respectively. S267F variant correlated significantly with a lower risk for cirrhosis (P=0.036), while there was no significant correlation with the risk for HCC (P=0.887). Among the 32 patients who had S267F variant (genotype CT), 10 had not received antiviral treatment; their median HBV DNA level was 2.0 log10 IU/mL. In contrast, the median HBV DNA level of the 477 antiviral treatment-naïve patients with wild-type NTCP (genotype CC) was 2.9 log10 IU/mL (P=0.179). Conclusion: We confirmed S267F variant of NTCP reduced HBV infection in vitro. Also, the uptake of HBV and UDCA occurs competitively in interaction with NTCP. The S267F variant of NTCP is clinically associated with lower risk of HBV infection and cirrhosis development in Korean patients with CHB.

서론: Sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP)는 최근 B형간염 바이러스의 수용체로 밝혀졌다. NTCP 수용체의 267번 위치에 serine에서 phenylalanine로의 치환 (S267F 변이)은 아시아에서 특이적인 변이로 in vitro 실험에서 B형간염 바이러스의 감염을 방해하는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 국내 만성 B형간염 환자들에서 S267F 변이의 유병률을 살펴보고 만성 B형간염 질병 경과와의 연관성에 대해 알아보고자 한다. 또한, 담즙산이 B형간염 바이러스의 세포 내 감염에 영향을 주는지 in vitro 실험을 통해 확인하고자 한다. 방법: S267F 변이가 B형간염 감염에 미치는 영향을 보기 위해 mutagenesis, transfection, virus inoculation과 ELISA 방법을 이용하였다. B형간염 바이러스의 경우 HepAD38 세포주를 이용하여 virus induction, supernatant collection 및 concentration, real-time PCR을 통한 정량화 방법으로 준비하였다. 만성 B형간염 환자 1,200명과 B형간염 표면 항원 음성인 176명에 대하여 NTCP의 S267F 변이를 조사하였다. 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하였고, 중합효소 연쇄반응-제한 효소 절편 길이 다형성 (PCR-RFLP)을 이용하여 S267F 변이 여부를 검사하였다. 또한, S267F 변이와 임상적 연관성에 대해서도 함께 분석하였다. 결과: HepG2-NTCP cell line을 이용한 in vitro 실험결과 NTCP 267F 변이가 B형간염 바이러스 감염에 음성적 효과 (negative effect)를 나타냈고, UDCA에 의해 용량 의존적으로 B형간염 바이러스 감염이 감소함을 확인하였다. NTCP의 267F 변이 (CT or TT 유전자형) 비율은 만성 B형간염 환자에서 2.7%, B형간염 표면 항원 음성인 군에서 5.7% 였고 (P=0.031), S267F 변이가 있는 경우 B형간염 감염에 덜 민감하다는 것을 확인하였다. S267F 변이의 비율은 만성 B형간염 환자에서 3.3%, 간경화에서 0.9%, 간암 환자에서 3.5% 였다. 통계적 분석 결과 S267F 변이가 있는 경우 간경화 발생의 위험이 낮아졌고 (P=0.036), 반면 간암 발생과는 통계적 유의성을 보이지 않았다 (P=0.887). S267F 변이가 있는 32명의 환자 중 10명의 환자가 이전에 B형간염 관련 치료를 받은 과거력이 없었으며 이들의 B형간염 바이러스 DNA 중앙값은 2.0 log10 IU/mL 이었다. 그러나 이전 항바이러스 치료력이 없고 동시에 S267F 변이가 없는 (CC 유전자형) 477명의 환자들의 B형간염 바이러스 DNA 중앙값은 2.9 log10 IU/mL (P=0.179)이었다. 결론: in vitro 실험을 통해 우리는 NTCP의 S267F 변이가 B형간염 바이러스의 감염을 감소시킴을 확인하였다. 또한 B형간염 바이러스와 UDCA의 세포 내 수용은 NTCP에 대하여 경쟁적으로 작용한다. NTCP의 267F 변...