Studies of the Human Complement factor B, a Novel Pancreatic Cancer Biomarker

Abstract

Proteomic analysis using pooled plasma from healthy donors and patients with chronic pancreatitis or pancreatic cancer (PC) identified complement factor b (CFB) as a candidate biomarker for PC. Immunoblot analysis of CFB revealed more than 2-fold higher expression in plasma samples from patients with PC compared with plasma from individuals without PC. Immunoprecipitation coupled with mass spectrometry analysis confirmed both chemical identity and higher expression of CFB in PC samples. CFB showed distinctly higher specificity than CA19-9 for PC against other types of digestive cancers and in discriminating PC patients from non-PC patients (p< 0.0001). In receiver operator characteristic curve analysis, CFB showed an area under curve of 0.958 (95% CI: 0.956–0.959) compared with 0.833 (95% CI: 0.829–0.837) for CA19-9. CFB also exhibited much higher specificity than CA19-9 (97.9% vs. 70.0%) with comparable sensitivity (73.1% vs. 80.4%). A combination of CFB and CA19-9, termed ComB-CAN, showed markedly improved sensitivity (90.1% vs. 73.1%) over that of CFB alone in the diagnosis of PC against non-PC, with similar specificity (97.2% vs. 97.9%). CFB alone or ComB-CAN showed an early (Ⅰ-Ⅱ) stage diagnosis ability with ≥ 90% sensitivity and 97% specificity. This early diagnostic function was further supported by immunoprecipitation and qRT-PCR assays in PC cell lines Our data implicate that CFB or ComB-CAN serve as a novel PC-specific serologic biomarker candidate and warrant further investigation into a large-scale validation and its biochemical role in the carcinogenesis of PC. To study the potential role for CFB in carcinogenesis of pancreatic cancer cell (PANC1), we prepared PANC1 cells treated with shRNA such as shContol (MOCK) and shCFB (CFB-knockdown) stable cell lines in PANC1. We also investigated CFB-related interactome through the analysis of both transcriptome and proteome. Both RNA-seq and MS analysis showed that those proteins involved in cell migration and invasion were down regulated in CFB-knockdown cells. It seems quite consistent that increase in CFB level is closely related to carcinogenesis in pancreatic cancer cells, supporting its role as a good PC marker.

췌장암의 새로운 바이오마커를 발굴하기 위해 정상인 13명, 췌장염 환자 12명, 췌장암 환자 13명의 혈장을 이용 하였고 형광 2차전기영동법(2-D DIGE)을 수행하여 유의적으로 췌장암 환자에서 증가된 단백질들을 동정하였다. 이들 단백질 중, 췌장암 환자의 혈장에서 현저히 증가하는 보체 인자 B (CFB)를 췌장암 바이오마커로 선정하였으며, 추가적으로 간암 13명, 위암 13명, 담관암 13명의 환자 혈장을 이용하여 웨스턴블럿을 통해 CFB가 췌장암에서만 특이적으로 높게 발현함을 확인하였다. 췌장암 진단 마커인 CA 19-9와 CFB의 췌장암 진단 효율을 비교하기 위해, 총 185개의 임상 혈장 (정상 44개, 췌장염 12개, 췌장암 41개, 담관암 22개, 위암 35개, 간암 31개)으로부터 ELISA 분석을 수행하였다. CFB는 췌장암 환자의 혈장에서 다른 그룹과 비교 했을 때 발현이 유의적으로 증가하였고 (p<0.0001), 췌장암과 다른 비교 그룹과의 구분에서 AUC는 각각 0.833 (CA 19-9), 0.958 (CFB), 0.986 (CA 19-9 + CFB)으로 나타났다. 이는, CFB가 다른 암이나 췌장염을 구분할 수 있는 효과적인 마커이며, 특히 CFB와 CA 19-9의 두 마커를 혼용했을 때 진단 효과는 CA 19-9만을 사용하였을 때보다 더욱 증가하였다. CFB의 췌장암 조기 진단 능력을 알아보기 위해 혈장을 이용하여 췌장암 병기별로 ELISA 분석을 수행하였다. 정상인 50명, 급성 췌장염 환자 50명, 만성 췌장염 환자 50명, 췌장암 1-2기 (초기 병기) 환자 100명, 췌장암 3-4기 (말기 병기) 환자 57명의 혈장을 사용하여 CFB와 CA 19-9의 발현 변화를 ELISA를 통해 확인하였다. CFB의 경우 CA 19-9보다 만성 췌장염과 초기 병기를 유의적으로 (p<0.0001) 더 잘 구분 하는 것으로 나타났고, CA 19-9는 췌장암 말기 병기에서 많이 발현을 하고 있는 반면, CFB는 췌장암 초기 병기에서 많이 발현함을 확인하였다. 이에 CFB가 췌장암을 조기에 진단 할 수 있는 능력이 얼마나 되는지 확인해 보았다. 췌장암 환자에게서 CFB와 CA 19-9의 진단율을 확인 한 결과 췌장암 초기 병기 일 때 CFB의 진단율은 75%로 나타난 반면 CA 19-9는 39%의 낮은 진단율을 보였다. 특히 CFB와 CA 19-9의 두 마커를 혼용 (ComB-CAN Panel) 했을 때 초기 진단율이 88%까지 올라감을 확인 하였다. 췌장암에서 CFB의 생물학적 기능을 알아보기 위해 CFB의 발현을 감소 시킨 세포주를 만들어 CFB와 상호작용 하는 유전자들과 단백질들을 RNA-seq과 LC-MS/MS를 통해 확인하였고, 이를 이용하여 CFB가 췌장암 세포의 전이와 이동에 영향을 줄 것이라고 예상하였다. 실제로 이를 확인한 결과 CFB의 발현을 억제 시킨 췌장암 세포주에서 전이와 이동이 감소함을 확인 하였다. 따라서, CFB는 췌장암을 일으키는 원인이 될 수 있을 것이고, 혈청학적 췌장암 조기 진단 마커로서 CA 19-9와 함께 임상에서 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.