TERT promoter mutations in B viral human hepatocarcinogenesis : Suppression of PROX1-induced TERT transcription by stable HBx expression

Abstract

Telomerase reverse transcriptase (TERT) promoter somatic mutations, related to telomerase activation, have been known to frequently occur at two hot spots located at -124 and -146 bp upstream of ATG in various cancers. In the present study, we investigated the occurrence and implications of the genetic alterations of the TERT promoter in B viral hepatocarcinogenesis. TERT promoter mutations, especially -124C>T mutation, obviously enhanced TERT promoter activity in hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines. We identified prospero homeobox protein 1 (PROX1) as a novel transcriptional activator for TERT gene through binding to the promoter regions containing two hot spots. PROX1 binding affinity was strong to the mutant TERT promoter harboring a consensus E-twenty six/ ternary complex factor (ETS/TCF) binding sequence (CCGGAA). The incidence of TERT promoter mutations gradually increased according to the progression of human B viral multistep hepaticarcinogenesis, which was found in 9.0% of low grade dysplastic nodules (LGDNs), 13.5% of high grade dysplastic nodules (HGDNs), 27.3% of early HCCs (eHCCs) and 28.4% of progressed HCCs (pHCCs). The occurrence of TERT promoter mutations correlated with lower levels of alpha-fetoprotein (AFP) (p=0.046) and a poor overall survival (p=0.012) in B viral HCC patients. On the contrary to in vitro data, TERT mRNA expression was lower in B viral HCCs with the mutant TERT promoter compared to those without. In addition, mRNA level of PROX1 was not correlated with that of TERT in B viral HCCs, in contrast that such correlation was evident in non-B viral HCCs. Interestingly, induction of stable HBx expression inhibited PROX1-mediated TERT expression in vitro study. In conclusion, our findings suggest that TERT promoter somatic mutations are early events in B viral human multistep hepatocarcinogeneis and HBx can induce a loss of PROX1 function as transcriptional activator for TERT expression.

Telomerase 활성화에 관련된 Telomerase reverse transcriptase (TERT) 유전자의 promoter 체세포 돌연변이는 다양한 암에서 발견되며, 돌연변이 다발점으로 알려진 ATG 개시 codon의 상류 (-124 bp와 -146 bp) 염기 서열에서 빈번히 발생한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 이러한 TERT promoter의 유전적 변이가 HBV 유래 간암 발생에서 어떠한 빈도로 나타나며 어떠한 작용 기전을 보이는지에 대하여 밝히고자 하였다. 간암 세포주를 이용한 실험을 통하여, TERT promoter의 돌연변이, 특히 염기 서열 -124 bp 지역의 변이는 TERT promoter 활성을 명백히 증가시켰다. 이러한 결과는 prospero homeobox protein 1 (PROX1) 단백질이 TERT promoter의 돌연변이 다발점에 결합하여 promoter 활성을 증가시키는 전사 활성인자로서의 기능에 관련된 것임을 새로이 확인하였으며, 특히 PROX1의 결합력은 TERT promoter의 돌연변이 결과로 생성된 E-twenty six/ ternary complex factor (ETS/TCF) 결합 서열 (CCGGAA)에서 증가함을 확인하였다. 또한 HBV 유래 간암 환자의 간 조직을 이용한 실험을 통하여, TERT promoter의 체세포 돌연변이 발생은 저등도 형성이상결절에서 9.0%, 고등도 형성이상결절에서 13.5%, 조기 간세포암종에서 27.3% 그리고 진행성 간세포암종에서 28.4%의 발생 빈도를 보여 간암으로 진행 시 TERT promoter의 체세포 돌연변이 발생이 점진적으로 증가함을 확인하였다. 그리고 이러한 TERT promoter의 돌연변이 발생은 HBV 유래 간암 환자에서 낮은 alpha-fetoprotein (AFP) 수치와 불량한 전체 생존율을 보였다. 하지만 생체외 실험 결과와는 달리, TERT promoter의 돌연변이를 지닌 HBV 유래 간암 환자에서 TERT mRNA 발현은 돌연변이를 지니지 않는 환자보다 낮았다. 또한 TERT mRNA 발현 정도는 PROX1 mRNA 발현 정도와 상관 관계를 보이지 않았다. 그러나 비 HBV 유래 간암 환자에서는 그 둘 간에 양의 상관 관계를 보였다. 이러한 현상은 흥미롭게도 HBx와 관련된 것으로, HBx가 안정 발현되는 간암 세포주에서는 PROX1 유도 TERT mRNA 발현이 저해됨을 확인하였다. 요약하면, TERT promoter의 체세포 돌연변이는 HBV 유래 간암 발생 과정 중 초기 단계에 나타나는 현상이며, HBx는 전사 활성인자 PROX1의 기능 저하를 야기하여 TERT mRNA 발현을 조절할 수 있음을 본 실험을 통하여 밝혔다.