한국인에서 플라즈미노젠 유전자의 Ala601-Thr 돌연변이 검색과 5' flanking 부위 염기서열 규명

Abstract

[한글]

한국인에서 플라즈미노젠 유전자의 Ala601-Thr 돌연변이 검색과 5'' flanking 부위 염기서열 규명혈전증 원인의 하나인 플라즈미노젠 결핍증은 혈장 플라즈미노젠 항원량과 활성도가 같이 감소하는 저플라즈미노젠혈증 (hypoplasminogenemia)과 항원량은 정상이나 플라즈미노젠의 기능이상으로 활성도만 감소하는 이상플라즈미노젠혈증 (dysplasminogenemia : dysPLGemia)의 두 가지 유형이 있다. 1996년 Tsutsumi 등은 일본인 125 가계 158 예의 이상플라즈미노젠혈증을 대상으로 시행한 연구에서 Ala601-Thr 돌연변이가 118 가계(94%)에서 발견되었으며 이 중 27%에서 혈전증이 동반됨을 보고한 바 있다. 또한 Kida 등은 일본인에서 플라즈미노젠 유전자의 5'' flanking 부위의 염기서열 분석 결과, 새로운 유전자형 II 형(haplotype II)을 발견하였으며 유전자형 I 형과 Ala601-Thr 돌연변이가 관련이 있음을 시사하였다. 이에 본 연구에서는 한국인 혈전증 환자 477 예 (남 291 예, 여 186 예, 평균 연령 61세)과 정상군 57 예 (남 29 예, 여 28 예, 평균 연령 50 세)를 대상으로 하였으며 혈전증 환자군은 관상동맥폐색질환 223 예, 뇌경색 165 예, 심부정맥혈전증 36 예, 말초동맥폐색질환 19 예, 폐색전 12 예, 다부위 혈전증 8 예 및 기타 혈전성 질환 14 예이었다. 플라즈미노젠 활성도는 STACHROM PLG (Diagnostica Stago, Asniers, France)을 사용한 비색법 (colorimetric assay)으로 측정하여 저플라즈미노젠혈증 환자를 검색하였다. 저플라즈미노젠혈증 환자를 대상으로 플라즈미노젠 항원량을 측정한 결과 정상 또는 증가를 나타낸 경우를 이상플라즈미노젠혈증으로 정하였다. 이상플라미노젠혈증을 대상으로 Tsutsumi 등(1996)의 방법에 따라 직접 염기서열분석을 시행하여 Ala601-Thr 돌연변이를 검색하였고 Fnu4HI효소에 의한 RFLP (restriction fragment length polymorphism)로 확인하였다. 또한 5'' flanking부위의 유전자형을 Kida 등(1998)의 방법에 따라 염기서열분석 및 RFLP를 시행하여 유전자형과 Ala601-Thr 돌연변이의 연관성에 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.1. 혈장 플라즈미노젠 활성도를 측정한 결과 정상군 (n=57)에서는 저플라즈미노젠혈증 (70%이하)이 한 예도 없는 반면, 혈전증 환자군 (n=477)에서는 40 예 (8.4%)가 저플라즈미노젠혈증을 나타내었다. 2. 저플라즈미노젠혈증을 보인 40 예에서 플라즈미노젠 항원량을 측정한 결과 간질환, 균혈증, 파종성 혈관내 응고증, 약물 (t-PA, urokinase) 사용 등 후천적 요인에 의한 저플라즈미노젠혈증을 제외한 20 예(50%)는 이상플라즈미노젠혈증의 진단에 합당하였다. 따라서 한국인 혈전증 환자군을 대상으로 한 이상플라즈미노젠의 빈도는 4.2%이었다.3. 이상플라즈미노젠혈증 20 예에서 Ala601-Thr 돌연변이 검색을 시행한 결과 16 예(80%)에서 발견되었다. 한국인에서 Ala601-Thr 돌연변이 발생빈도는 혈전증환자군에서 3.4% (16/477), 전체 대상군에서 2.9% (16/534)로 추정되었으며 혈전 질환별 발생빈도는 관상동맥질환 223 예 중 8 예(3.5%), 뇌경색 165 예 중 5 예(3.0%), 심부정맥혈전증 36 예 중 3 예(8.3%)이었다.4. 5'' flanking 부위의 염기서열 및 PCR-RFLP 분석 결과, 제 I 대립인자 빈도는 Ala601-Thr 돌연변이 양성군에서 0.5313으로 음성군에서의 0.1379에 비하여 유의하게 높았다 (p < 0.0001).5. 정상군 57 예와 관상동맥질환자군 22 예에서 시행한 5'' flanking 부위의 염기서열분석 결과 정상군은 I/II 형 14 예(24.6%), II/II 형 43 예(75.4%)였으며 관상동맥질환자군은 I/II 형 12 예(54.5%), II/II 형 10 예(45.5%)의 분포를 보였다. 이러한 유전형 분포의 차이는 정상군과 유의한 차이가 있어 5'' flanking 부위의 유전형이 관상동맥질환과 관련이 있음을 시사하였다 (p=0.0110).이상의 결과를 종합할 때 한국인 혈전증에서 이상플라즈미노젠혈증의 발생 빈도는 4.2%였으며 이 중 Ala601-Thr 돌연변이는 80%의 높은 빈도로 검색되었다. 따라서 국내에서도 혈전증환자에서 혈장 플라즈미노젠의 검사의 실시가 필요하며 이상플라즈미노젠혈증으로 진단된 경우 유전자 검사를 통한 돌연변이 검색이 필요할 것으로 생각되었다. 향후 더욱 많은 정상인과 돌연변이 가계를 대상으로 혈전증의 발생위험인자로서의 광범위한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

[영문]Plasminogen (PLG) is a key proenzyme of plasmin in the fibrinolytic and thrombolytic systems. Congenital deficiency of PLG (hypoplasminogenemia, hypoPLGemia) and dysPLGemia (dysplasminogenemia) are known to be associated with mild thrombophilia. Tsutsumi et al. (1996) have reported that the Ala601-Thr mutation accounted for about 94% cases of dysPLGemia in 118 unrelated Japanese families. Kida et al. (1998) found a new haplotype (allele II) of 5'' flanking region in the PLG gene in association with Ala601-Thr mutation.In this study, plasma activities of plasminogen were measured by colorimetric assay using STACHROM PLG (Diagnostica Stago, Asniers, France) for the screening of hypoplasminognemia in 477 patients (291 men, 186 women, mean age 61 yrs) with thrombosis, including 223 coronary artery obstructive disease (CAOD), 165 ischemic stroke, 36 deep vein thrombosis, 19 peripheral artery obstructive disease, 12 pulmonary embolism, 8 multiple thrombosis, and 14 other thrombosis, and in 57 healthy subjects (29 men, 28 women, mean age 50 yrs). For the detection of dysPLGemia and Ala601-Thr mutation, PLG antigen levels were also assessed by immunologic methods and genetic analysis was performed by DNA sequencing and restriction fragment length polymorphism(RFLP) according to the method by Tsutsumi et al.(1996) in cases with hypoPLGemia. In addition, RFLP analysis in the 5'' flanking region of PLG gene was performed to observe the possible association with Ala601-Thr mutation according to the method by Kida et al. (1998).The results were as follows; 1. In the measurement of PLG activities, there were no cases with hypoPLGemia in the normal group (n=57), while 40 cases (8.4%) of the thrombosis group (n=477) had hypoPLGemia.2. Among 40 cases with hypoPLGemia, 20 cases (50%) were found to have dysPLGemia with normal antigen levels and the remaining 20 cases had hypoPLGemia due to acquired conditions such as liver dysfunction, consumptive coagulopathy or drug therapy.3. Among 20 cases with dysPLGemia, 16 cases (80%) were found to have the Ala601-Thr mutation in the PLG gene. The frequecny of Ala60-Thr mutation was estimated to be 0.0171 in Korean patients with thrombosis.4. Allelic(I) frequency in the 5'' flanking region in the group with Ala601-Thr mutation was 0.5313, which was significantly higher than in the group (0.1379) without Ala601-Thr mutation.5. There was statistically significant difference of genotype frequency in the 5'' flanking region between normal group and patients with coronary artery obstructive disease (i.e., I/II 14(24.5%), II/II 43(75.4%) in normal group; I/II 12(54.5%), II/II 10(45.5%) in CAOD group).In conclusion, this study suggests that dysPLGemia with Ala601-Thr mutation is present with relatively high frequency in patients with thrombosis in Korean and/or pulmonary embolismpopulation. Therefore, PLG screening tests need to be included for work-up in the patients with thrombosis as well as in family study for the evaluation of genetic defect in the PLG gene.