Leukotactin-1-induced signal transduction through CCR1 in human osteogenic sarcoma cells

Abstract

[한글]

Leukotactin-1 (Lkn-1)은 최근에 클론된 CCR1과 CCR3에 결합하는 CC chemokine이다. Lkn-1이 중성구, 단핵구, 림프구의 화학주성제로서 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 세포내 기전은 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 실험에서는 Lkn-1에 의해 유도되는 화학주성 신호전달과정을 이해하기 위해서 CCR1을 발현하는 사람 골수종세포에서 화학주성 활성도를 연구하였다. Lkn-1에 의해 유도되는 화학주성에 관련된 분자들을 조사하기 위해서 세포유주실험을 수행하였다. Gi/Go 단백질의 억제제인 pertussis toxin과 인지질 가수분해효소 C와 단백질 인산화효소 C의 억제제는 Lkn-1에 의해 유도되는 화학주성을 감소시켰다. 특히 단백질 인산화 효소 Cd의 특이적 억제제인 rottlerin은 Lkn-1의 화학주성 활성도를 억제시켰는데, 이것은 Lkn-1의 화학주성 신호전달과정에서 단백질 인산화효소 Cd가 관여하는것을 나타낸다. 인지질 가수분해효소 C와 단백질 인산화효소 C의 활성도는 Lkn-1의 자극에 의해서 증가하였다. 그러나, MEK 억제제인 PD98059는 화학주성 활성도를 억제시키지 않아서 ERK가 관여하지 않는다는 것을 보여주었다. Lkn-1에 의한 화학주성 활성도는 cyclonheximide 와 actinomycin D에 의해서

억제되는데 이는 화학주성에 새로운 단백질의 합성이 필요하다는 것을 나타낸다. 새로운 단백질 합성을 위해서는 전사인자의 활성화가 요구되는데, 이 중에서 가장 잘 알려져 있는 NF-kB가 관련하는지를

조사하였다. NF-kB의 억제제는 화학주성 활성도를 감소시켰고, gel shift assay 결과 Lkn-1의 자극에 의해서 NF-kB의 DNA 결합능력이 증가되었다. 이러한 결과는 Lkn-1에 의한 화학주성 신호전달이 Gi/Go

단백질, 인지질 가수분해효소 C, 단백질 인산화효소 Cd, NF-kB을 거쳐 새로운 단백질합성으로 이어지는것을 나타낸다.

Lkn-1이 CCR1에 결합한 후에 일어나는 세포내 신호전달에 대한 연구를 위해서 CCR1을 발현하는 사람골수종 세포주의 신호분자 활성도를 실험하였다. Lkn-1에 의해 자극받은 세포는 시간별로 인산화된 ERK1/2를 증가시켰다. ERK의 활성도는 30분과 12시간에 최고점에 이르렀고, pertussis toxin에 의해서ERK의 활성도가 감소하였다. 인지질 가수분해효소 C와 단백질 인산화효소 Cd의 억제제도 또한 ERK의활성도를 감소시켰다. c-fos, c-myc, egr-1 같은 immediate early response genes은 Lkn-1에 의해 유도되어졌다. Lkn-1이 Gi/Go 단백질, 인지질 가수분해효소, 단백질 인산화효소 Cd를 통하여 ERK를 활성화시키는데 이러한 결과는 세포증식과 분화 그리고 유전자발현조절과 같은 다른 세포내 과정에Lkn-1에 의해 유도되어진 ERK 활성화가 관여할 수 있다는 가능성을 제시한다.

[영문]

Leukotactin-1 (Lkn-1) is a recently cloned CC-chemokine that binds to the CCR1 and CCR3. Although Lkn-1 has been known to function as a chemoattractant for neutrophil, monocyte and

lymphocyte, its cellular mechanism remains unclear. To understand the mechanism of Lkn-1-induced chemotaxis signaling, the chemotactic activities were examined in human osteogenic sarcoma (HOS) cells expressing CCR1. Cell migration experiment was performed to examine the molecules involved in Lkn-1-induced chemotaxis. Pertussis toxin, an inhibitor of Gi/Go protein, and inhibitors of phospholipase C (PLC), and protein kinase C (PKC) blocked Lkn-1-induced chemotaxis. Especially, PKCd specific inhibitor rottlerin inhibited the chemotactic activity of Lkn-1 indicating that Lkn-1-induced chemotaxis signal is tranduced through PKCd. The activities of PLC and PKCd were also enhanced by Lkn-1 stimulation. However, MEK inhibitor PD98059 did not inhibit the chemotaxis induced by Lkn-1 indicating that extracellular signal-related kinase (ERK) pathway is not involved in cell migration. Chemotactic activity of Lkn-1 was inhibited by the treatment of cycloheximide and actinomycin D suggesting that newly synthesized proteins are needed for chemotaxis. The inhibitor of NF-kB inhibited Lkn-1-induced chemotaxis. Results from gel shift assay showed that the DNA binding activity of NF-kB was enhanced by Lkn-1 stimulation, and these results suggest that Lkn-1 transduces the signal through Gi/Go protein, PLC, PKCd, NF-kB and newly synthesized proteins for chemotaxis.

To understand the intracellular events following Lkn-1 binding to CCR1, the activities of signaling molecules in response to Lkn-1 were investigated in HOS cells expressing CCR1. Lkn-1-stimulated cells showed elevated phosphorylationof ERK1/2 with a distinct time course. ERK activation was peaked in 30 min and 12 h and pertussis toxin blocked Lkn-1-induced activation of ERK showing biphasic activation of ERK. PLC inhibitor and PKCd specific inhibitor inhibited ERK activation in Lkn-1-stimulated cells. Dominant negative Ras inhibited activation of ERK. Immediate early response genes such as c-fos and c-myc were induced by Lkn-1 stimulation. Lkn-1 affected the cell cycle

progression by cyclin D3 induction. These results suggest that Lkn-1 activates the ERK pathway by transducing the signal through Gi/Go protein, PLC, PKCd and Ras, and it may play a role for cell

proliferation, differentiation and regulation of gene expression for other cellular processes.