Arsenic Trioxide (As2O3)-induced apoptosis and MAP kinase signaling mechanism in chronic myelogenous leukemia K562 cells

Abstract

[한글]

만성 골수성 백혈병 (CML)은 모든 성숙단계의 골수구계 세포의 증식과 세포유전학적으로 필라델피아 염색체를 특징적으로 나타내는 조혈모세포 질환으로 CML 세포주인 K562세포는 bcr-abl 융합유전자에 의한 tyrosine kinase의 높은 활성에 의해 발생되는 백혈병 세포이다. 여러 자극에 대해 상당히 높은 apoptosis 내성을 가지고 있어 치료에 또한 어려움이 많은 질환 중의 하나이다.

최근 arsenic trioxide (As2O3)는 all-trans retinoic acid에 내성을 보이거나, 재발된 급성 전골수성 백혈병 환자의 치료에 있어서 좋은 효과를 보였음을 보고한 이래로 다른 악성 질환 및 골수증식성 질환 등에서도 실험이 진행 중에 있다. 본 연구에서는 bcr-abl 융합유전자를 가진 K562세포를 이용하여 As2O3가 apoptosis에 미치는 영향과 mitogen-activated protein (MAP) kinase와 관련된 작용기전에 대해 알아보고자 하였다.

우선 K562세포에 대한 As2O3의 세포 독성능에 대해 살펴 본 결과 24시간 배양시 50% 세포독성을 나타내는 IC50은 10 mM로 나타났으며, 전자현미경 및 형광현미경을 통해 핵의 분절, 염색질 응축, apoptotic body 등 apoptosis로 진행되는 세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다. Apoptosis의 특징인 DNA 분절이 20 mM의 As2O3처리 12시간과 24시간에서 형성됨을 1.8% agarose 전기영동을 통해 확인하였다.

또한 As2O3 처리에 의한 caspase-3의 활성 증가를 관찰하였고, caspase 억제제인 Z-VAD-fmk를 함께 처리한 경우 As2O3만 처리한 군에 비해 세포독성이 감소하였고 DNA 분절능이 억제된 결과를 통해 caspase-3가 apoptosis mediator로서 작용한다는 것을 확인하였으며,

As2O3가 세포주기에 영향을 미치는지 알아보고자 시간별, 농도별로 처리하여 유세포 분석을 통해 세포주기 변화를 측정한 결과, G2/M 세포의 비율이 높게 나타남을 확인하였다.

그리고, Western blot 분석을 통해 As2O3에 의한 Bcr-Abl oncoprotein 발현변화를 관찰한 결과, 대조군에 비해 As2O3 처리시 감소되었음을 확인하였고, RT-PCR에 의한 bcr-abl 융합유전자 검출에서도 대조군과 10 mM 처리군에서는 305 bp의 위치에서 band가 관찰되었으나, As2O3 20 mM 처리 후에는 거의 관찰되지 않음을 통해, As2O3가 Bcr-Abl 단백질의 down-regulation에 관여함을 확인하였다.

다음으로 As2O3에 의해 유도되는 apoptosis와 관련된 신호전달과정 중 MAP kinase와 관련하여 알아보았다. As2O3처리에 의한 apoptosis과정 중 p38, 그의 upstream으로 작용하는 MEK 3/6, 그리고 transcription factor인 ATF-2의 활성이 증가되었음을 Western blot

분석을 통해 확인하였다. P38의 inhibitor인 SB203580의 전처리시 As2O3로 유도되는 DNA 분절능의 억제와 apoptotic cell death가 억제됨을 확인함으로써 apoptosis와 p38 MAP kinase의 관련성을 뒷받침하였다. 그러나, SB203580 처리 후 세포 독성능과 세포주기 변화에 미치는 영향을 살펴본 결과 매우 의미있게 감소되지 않음을 보아서 As2O3에 의한 apoptosis에 있어서 p38 kinase만으로는 충분하지 못하며 다른 요인이 작용할 것이라 보며 이에 대한 추후 연구가 계속되어야 될 것 이다.

위의 실험 결과를 통해 K562 CML 세포주는 As2O3에 의해 apoptosis가 유도되었으며, 이 과정에서 caspase-3의 활성증가와 Bcr-Abl 단백질의 down-regulation 및 mRNA의 소실 등을 확인하였다. 그리고 이와 관련된 신호전달기전은 MAP kinase family 중에서 p38 kinase pathway가 관여한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 As2O3에 의한 apoptosis 기전을 응용함으로써 CML에 있어서 새로운 치료제의 가능성에 관한 정보의 제공과 함께 임상적 응용에도 도움을 줄 것으로 생각된다.

[영문]

Arsenic trioxide (AS2O3) has recently been demonstrated to be an effective inducer of apoptosis in patients with relapsed acute promyelocytic leukemia (APL) and in patients with APL in whom all-trans-retinoic acid and conventional chemotherapy failed. Chronic myelogenous leukemia (CML) cells are highly resistant to

chemotherapeutic drugs. This resistance is mediated by the chimeric tyrosine kinase oncogene bcr-abl.

To determine if AS2O3 might be useful for treatment of CML, the ability of AS2O3 to induce apoptosis in K562 cells was examined. In vitro cytotoxicity of AS2O3 was evaluated in K562 cells by MTT assay. The IC50 value for AS2O3 was to be 10 μM. When analyzed by agarose gel electrophoresis, the DNA fragmentation became evident after the incubation of the cells with μM of As2O3 for 12 h and 24 h, respectively. Morphological changes and chromatin condensation of the cells undergoing apoptosis were also observed. After the treatment of 20 μM As2O3, activation of caspase-3 increased at 12 h and 24 h and decreased at 36 h and 48 h. In addition, pretreatment of Z-VAD-fmk, a specific inhibitor of caspase, decreased As2O3-induced cytotoxicity. And DNA flow cytometric analysis showed that As2O3 induce G2/M arrest in these cells. The effect of As2O3 on expression of Bcr-Abl oncoprotein was also examined. In result, the treatment of As2O3 downregulated not only the expression of Bcr-Abl oncoprotein but also bcr-abl mRNA levels, suggesting a transcriptional regulation.

Next, to examine how As2O3 affects the mitogen-activated protein (MAP) kinase signaling pathway, the relationship between MAP kinase response in K562 cells treated with As2O3 was investigated. As2O3 at 10 μM strongly induced the activation of p38, and JNK 1/2, while ERK 1/2 were inhibited. MEK 3/6, which acts on upstream of p38, and ATF-2, a transcription factor, were also activated after treatment of As2O3. In addition, pretreatment of SB203580, a specific inhibitor of p38, blocked As2O3-induced DNA fragmentation apoptotic cell death. These results suggest that As2O3 is able to induce the apoptotic activity of K562 cells and its mechanism may be associated with down-regulation of Bcr-Abl oncoprotein, the activation of caspase-3 and p38 kinase. This result implicates that As2O3 may be a potential agent for treatment of CML.