The activation of NF-kB and AP-1 in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with diabetic nephropathy

Abstract

[한글]

당뇨병성 신증은 인슐린 저항성과 고혈당을 대표로 하는 당뇨병의 대사장애와 고혈압, 이상지질혈증 및 혈액응고 장애 등 관련인자의 복합적 작용에 의하여 발생한다. 최근 기존의 위험인자들이 산화성 스트레스 증가를 통하여 세포내 신호전달체계 및 염증성 반응에 작용함에 따라 당뇨병성 신증을 야기한다는 생체외 실험 결과들이 제시되었다. 따라서 본 연구는 정상인 (I군), 신증이 없는 제2형 당뇨병 환자 (II군) 및 당뇨병성 신증 환자 (III군)를 대상으로 당뇨병성 신증의 병인에서 산화성 스트레스 및 전사인자들의 역할을

평가하고자 하였다.

그 결과, 형광분석법으로 측정한 산화성 스트레스의 지표인 활성산소족(ROS)의 기저치 및 H₂O₂ 또는 PMA에 의한 자극치가 III군 에서 II군 및 I군에 비하여 현저히 높게 관찰되어 (기저치: 60.7±3.3 vs 60.0±3.0, 41.1±2.4 ; H₂O₂에 의한 자극치: 21.8±2.2 vs 11.1±2.0, 9.1±4.0 ; PMA에 의한 자극치 ; 23.5±4.5 vs 21.6±2.2, 12.1±3.0, 모두 p<0.05), 당뇨병성 신증과 산화성 스트레스가 연관성이 있음을 알 수 있었다.

세포내 산화-환원 상태에 의해서 조절되는 여러 전사인자들 중에서 NF-κB, AP-1 및 Sp1의 활성도를 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)로 측정한 결과, I군에 비하여 II군에서 AP-1 (1.4392±0.3087 vs 1.0003±0.1773, p<0.05), Sp1 (1.3881±0.1892 vs 1.0000±0.1665,p <0.05)의 활성도의 차이를 보이지만, NF-κB의 차이를 보이지는 않았고, 반면에 III군에서는 AP-1 (2.7096±0.4824 vs 1.0003±0.1773, p<0.05) 및 Sp1 (1.4521 ±0.2052 vs 1.0000±0.1665, p<0.05) 뿐만 아니라, NF-κB의 활성도의 유의한 차이를 (1.9043±0.3020 vs 0.9999±0.0843, p<0.05) 보였다. 또한, II군과 III 군간에는 Sp1의 차이는 없었으나, NF-κB 및 AP-1의 차이를 보였다.

한편, 요중 및 세포내 TGF-β₁는 III군에서 II군에 비해 유의하게 높았으나(16.8758±6.8399 vs 5.6069±1.5696, 3.2265±0.3901 vs 1.9921± 0.6785, 모두 p<0.05), II군 및 I군간의 요중 및 세포내 TGF-β₁의 차이는 유의하지 않았다. 또한, 요중 및 세포내 TGF- β₁는 24시간 알부민 배설률, NF-κB 및 AP-1의 활성도와 양의 상관관계가 각각 있었다. 따라서, NF-κB 및 AP-1 등의 체내 산화-환원체계에 관련된 전사인자가 당뇨병성 신증의 병인에 영향이 있음을 알 수 있었다.

이상의 결과는 당뇨병 환자의 PBMC에서 증가한 세포내 활성산소족 생성, NF-κB와 AP-1의 활성화가 PBMC의 TGF-β₁의 증가 뿐 아니라, 요중 TGF-β₁ 분비와 단백뇨와 양의 상관관계가 있음을 보여주었다. 이는 당뇨병 환자에서 산화성 스트레스 증가와 그에 따른 PBMC의 활성화가 당뇨병성 신증의 발생이나 진행에 관여할 수 있음을 시사한다.

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핵심되는 말: 당뇨병성 신증, 산화성 스트레스, NF-κB, AP-1, Sp1, TGF-β₁

[영문]

Diabetic nephropathy results from complicated interactions between metabolic abnormalities, such as hyperglycemia, insulin resistance, and dyslipidemia, hy- pertension, and coagulation abnormality. The results of cell culture studies su- ggest that these conventional risk factors may activate renal cells by altering intracellular signaling pathways initiated by reactive oxygen species (ROS) and that this leads to renal injury in patients with diabetes. Thus, the aim of this study was to evaluate the possible role of oxidative stress in renal injury of

diabetic patients by measuring intracellular ROS generation and the acti- vation of redox-sensitive transcription factors, including nuclear factor- kappa B (NF-κB) and activator protein-1 (AP-1), in isolated peripheral blood mo- nonuclear cells.

The expression levels of Specificity protein1 (Sp1) were also measured since Sp1 can be activated through hyperglycemia-induced glycosy- lation, which depends on ROS generation.

Dichlorodifluorescein (DCF)-sensitive intracellular ROS was measured by fluo- rescent spectrometry. Spontaneous and H₂O₂- or phorbol-12-myristate-13-ace- tate (PMA) - stimulated ROS were significantly higher in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with diabetic nephropathy (Group III) than in those without (Group II), and these were also higher in healthy control subjects (Group I). Moreover, spontaneous intracellular ROS levels in PBMCs from Groups I, II, and III were 41.1±2.4%, 60.7±3.3, and 60.0± 3.0, respectively, and H₂O₂(100M) increased intracellular ROS generation by 21.8% in Group III, 11.1% in Group II, and 9.1% in Group I.

The activities of transcription factors, such as NF-κB, AP-1, and Sp1 in PBMCs were measured by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Group II had a 1.4 - fold higher AP-1 activity and a 1.3 - fold higher Sp1 activity than Group I but similar NF-κB activity. On the other hand, Group III had 2.53 - fold higher NF-κB activity, a 2.0 - fold higher AP-1 activity and a 1.43-fold higher Sp1 activity than Group I. Moreover, the activities of NF-κB and AP-1, but not of Sp1, were significantly higher in Group III than in Group II.

The expressions of TGF-β₁in both PBMCs and urine were higher in Group III than Group II. TGF-β₁protein (ng/mg of protein) in PBMCs was 3.23±0.39 in Group III and 1.99±0.68 in Group II. Urinary TGF-β₁protein (ng/ ml) was 16.88±6.84 in Group III, and 5.61±1.57 in Group II. No difference in TGF-β₁protein expression was observed in PBMCs or in the urine of Groups I and II. Both urinary TGF-β₁excretion and PBMC-TGF- 1 were significantly correlated with NF-κB and AP-1 activity in PBMCs and in 24 hour urine albumin excretion (UAE) levels.

In conclusion, the present study demonstrates that intracellular ROS generation, and NF-κB and AP-1 activation in PBMCs strongly correlate with 24 hour UAE and TGF-β₁expression in urine and PBMCs. These clinical results suggest that increased oxidative stress in PBMCs may play a role in the pathogenesis of renal

injury in diabetic patients.