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The growth arrest mechanism of the internal radiotherapy using Holmium-166 in B16 melanoma

Other Titles
 B16 흑색종에서 Holmium-166을 이용한 체내 방사선치료의 성장억제 기전. 
Authors
 한병희 
Issue Date
2001
Description
Brain Korea 21 Project for Medical Sciences/박사
Abstract
[한글]

악성 흑색종의 발병률은 지난 20여년간 실질적으로 증가해 왔다. 병소의 완전한 수술적 절제가 오랜 기간의 무병생존 (disease free survival) 에 이르게 하는 유일한 치료방법이며 방사선 치료나 화학요법등이 성공적이라는 증거는 없다. 실제로 악성 흑색종은 방사

선에 저항성이 높다고 알려져 있다. 본 실험에서는 흑색종에서 Ho-166을 이용한 체내 방사선 치료의 효과와 기전을 알아보고자 하였다. 이를 위해 B16 흑색종 세포를 섭씨 37도에서 RPMI 1640 배지에 배양하였고, 5×10^5개의 세포가 들어있는 100㎕의 생리식염수 현

탁액을 C57BL/6 mouse의 배측 피하에 접종하였다. 생존율을 알아보기 위해서 40마리의 mouse를 두 군응로 나누어 제 1군 20마리에서는 생리식염수 0.3㎖를, 제2군 20마리에서는 Holmium-166 5 mCi가 함유된 생리식염수 0.3㎖를 종양의 내부에 주사하였다. 방사성 동위원소 주사후 mouse의 생존을 mouse가 사망할 때까지 측정하였다. 또다른 30마리의 mouse는 방사선 효과의 기전을 알아보기 위해서 같은 방법으로 준비하였다. 30마리를 5 mCi Ho-166을 함유한 0.3㎖ 생리식염수를 주사한 후 무작위로 5마리씩 여섯 군으로 나누어 1일,

2일, 3일, 6일, 14일째 되는 날 한 군씩 희생시킨 후, p53 종양 억제인자와 p53 downstream effector gene을 면역조직화학검사와 RT-PCR을 이용하여 알아보았고, 세포고사는 TUNEL 염색과 유세포분석을 이용하여 알아보았다. 대조군은 종양이 빠르게 성장하여 평균종양

부피가 초기부피의 약 30배에 달했다. 대조군 중 생리식염수를 주사한 후 16일 이후까지 생존한 mouse는 한 마리도 없었다. 대조군의 median survival은 생리식염수 주사후 9일이었고 Ho-166 치료한 군에서는 33일이었다. 치료한 군의 조직학적 검사에서 광범위한 중심부 괴사를 보였는데, 이는 Ho-166이 침착된 영역과 일치하였고 생존 종양 세포들은 주변부에 분포하였으며 세포고사의 소견은 보이지 않았다. bax mRNA의 발현은 치료 후 48시간까지 증가되었다가 그 이후 점차 감소하였으나 2주후까지 여전히 대조군보다 증가되었고,p53과 p21의 발현은 치료 후 48시간까지 증가되다가 그 이후 감소하였는데, 이는 면역조직학적 소견과 밀접하게 연관되어 있었다. TUNEL 양성인 핵은 치료 후 2일부터 2주까지 관찰할 수 있었으나 세포고사의 소견은 보이지 않았다. 유세포분석 역시 세포고사의 소견을 발견할 수 없었다. 이러한 결과들을 통해 볼 때, Ho-166 근접치료는 흑색종의 치료에 유용하며, 베타선 방출 동위원소를 사용한 고용량의 지속적인 방사능 조사의 치료 기전은괴사나 이차적 괴사와 이로 인한 성장 지연에 의한 것으로 생각된다.



[영문]

The incidence of malignant melanoma has been substantially increasing over the past two decades. Complete surgical excision of the tumor is the only proved therapeutic strategy that leads to long-term disease free survival and radiotherapy and/or chemotherapy have not been proved to be successful. Actually malignant melanoma has been known to be resistant to radiation. In this study, we evaluated the effectiveness and mechanisms of internal radiotherapy using Holmium(Ho)-166. B16 melanoma cells were cultured at 37℃ in RPMI 1640 media, and 5x10^5 cells

suspended in 100μl of normal saline were inoculated into subcutaneous layer in the back of C57BL/6 mice. To evaluate survival rate a total of 40 mice were divided into 2 groups and 0.3 ml of saline alone (group 1, n=20) and carrier free Ho-166 5

mCi (group 2, n=20) in 0.3 ml of saline were injected intra-tumorally. The survival of the mice after injection of the radionuclide was observed until the mice died. Additionally, 30 mice were prepared with the same method as previously described to evaluate the mechanism of the radiation effect. They were divided randomly into 6 groups and five mice in each group were sacrificed by cervical dislocation just before, 1^st, 2^nd, 3^rd, 6^th, and 14^th days after the injection of 5 mCi of Ho-166 in 0.3 ml of saline. Change of p53 tumor suppressor and its downstream effector genes were evaluated by using immunohistochemistry and RT-PCR and apoptosis was evaluated by TUNEL staining and flow cytometry. Control group showed

rapid tumor growth and the mean tumor volume reached approximately 30 times of its original volume. None of control group was alive until 16^th day after the injection of normal saline with median survival of 9 days. The median survival was

33 days in the treated group. Histological examination demonstrated wide central necrosis that matched with the area of Ho-166 deposition and viable tumor cells were distributed along the peripheral margin without cytologic features of apoptosis. Expression of bax mRNA increased substantially until 48 hours after treatment and then decreased, however, overall higher than control. But expression of p53 and p21 increased until 48 hours after treatment and then decreased. RT-PCR finding was closely correlated with the results of immunohistochemistry. TUNEL

positive nuclei were observed from 2 days until 2 weeks after treatment despite cytologic features of apoptosis was not noted. Flow cytometry also did not demonstrate any results supporting apoptosis. These results suggest that Ho-166 brachytherapy is useful for the local treatment of melanoma and the therapeutic

mechanisms of high dose continuous irradiation using beta-emitting agent are necrosis or secondary necrosis with resulting growth arrest.
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URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/137692
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