Characterization of a biphenyl isoxazole, KRIBB3, as an anti-migratory and anti-mitotic compound in cancer cell

Abstract

[한글]

암이 생명에 위협이 되는 가장 큰 원인은 암세포의 전이성에 있으며, 암으로 인한 사망의 대부분은 암 전이로 설명된다. 따라서, 암세포의 침윤과 전이에 필수적인 세포이동이 암 치료에 있어서 좋은 치료 표적이 될 수 있다. 암세포이동을 억제하는 화합물을 찾기 위해서 화합물은행으로부터 분양 받은 합성화합물을 대상으로 탐색한 결과 CAC-1098 (aurintricarboxylic acid) 및 CBI-0997 (5-(2,4-dimethoxy-5-ethyphenyl)-4-(4-Bromophenyl) isoxazole) 두 개의 화합물이 유방암 세포주인 MDA-MB-231의 암세포이동을 IC50값 5및 50 nM 농도에서 각각 저해하였다. 특히, CBI-0997의 브롬 위치를 메톡시로 치환한 KRIBB3 (5-(5-ethyl-2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-(4-methoxyphenyl) 화합물도 MDA-MB-231 세포에서 세포이동과 세포침윤 억제 활성을 나타내었으며, KRIBB3화합물은 CBI-0997 보다 좋은 drug-like 구조이기 때문에 세포이동억제 메커니즘을 규명하는 일에 이 화합물을 사용하였다. KRIBB3화합물에 결합하는 단백질을 동정하기 위해 바이오틴(biotin)을 결합한KRIBB3를 합성하였으며, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법을 이용해서 KRIBB3의 타깃 단백질이 Hsp27 단백질이라는 것을 동정하였다. MDA-MB-231 세포주에 PKC 활성물질인 PMA를 처리하였을 때 PKC에 의존적으로 Hsp27을 인산화 시켰으며, 세포 이동 또한 유도하였다. 대조적으로, KRIBB3를 처리한 세포주에서는 PMA에 의한 Hsp27의 인산화와 세포이동을 저해 시켰다. 또한, Hsp27을 과발현 시켰을 때 KRIBB3에 의한 세포침윤의 억제효과가 상쇄되는 것을 알 수 있었고, siRNA로 Hsp27의 발현 양을 감소시켰을 때 세포이동을 감소시키는 것을 알 수 있었다. 이 모든 결과를 종합해 볼 때 KRIBB3가 직접적으로 Hsp27 단백질과의 결합을 통해서 PKC에 의한 Hsp27단백질의 인산화를 저해하고 그에 따라 암 세포의 이동과 침윤을 억제한다는 것을 보여주고 있다.

KRIBB3의 여러 항암활성을 관찰하는 동안 KRIBB3가 여러 암세포에서 세포 성장을 억제 시킨다는 것을 관찰하였다. 특히, 인간 결장암 세포주인 HCT-116에서 GI50 값이0.35 μM 농도에서 세포 성장을 억제하였다. Flow cytometry 연구에서 KRIBB3가 세포주기중 G2/M 기에서 세포주기를 정지시키고 세포사멸을 유도한다는 것을 관찰 하였고, 이 사실은 Cyclin B1의 축적과 세포사멸 마커인 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 절편(cleavage)의 형태를western blot으로 증명하였다. 면역침강 법으로 관찰한 결과, KRIBB3를 처리한 초기에 APC/C의 활성인자인 p55CDC와 억제단백질인 매드2(Mad2)와의 결합이 유도된다는 것을 확인하였으며, 이는 KRIBB3에 의해서 유사분열 검사점(mitotic checkpoint)이 활성화 되었다는 것을 보여주고 있다. 그러나, 매드2와 p55CDC의 억제결합은 KRIBB3처리 후 24 시간 때에 점차 감소하기 시작해 48 시간 때에는 관찰되지 않았으며, 이는 유사분열 검사점에서 세포가 빠져 나왔다는 것을 의미한다. 이러한 실험결과들을 볼 때 KRIBB3 가 미세소관(microtubule)을 망가뜨려서 유사분열 검사점을 활성화 시켰다는 것을 보여준다. 이에 따라, 인 비트로(in vitro)와 인 비보(in vivo) 실험인 튜뷸린 중합반응(tubulin polymerization)과 면역형광 염색 실험을 통해서 관찰한 결과 KRIBB3가 튜뷸린 억제제라는 것을 증명하였다. KRIBB3에 의한 일시적인 백스(Bax)의 활성은 PARP절편과 유사하게 관찰되었는데 이는 KRIBB3에 의한 세포사멸이 백스를 통해서 일어난다는 것을 보여주었다. KRIBB3 50 mg/kg 또는 100 mg/kg를 누드마우스의 복강에 투여했을 때, 49.5% 또는 70.3%의 종양성장 억제활성을 나타내었다. 따라서, KRIBB3가 항암치료에 좋은 항암제 후보물질이라는 것을 보여주고 있다.

[영문]

Cell migration is a prerequisite for cancer invasion and metastasis, suggesting cell motility as a potential therapeutic target for cancer treatment. A synthetic library was screened to identify inhibitors of tumor cell migration. From this, I discovered CAC-1098 (aurintricarboxylic acid) and CBI-0997 (5-(2, 4-dimethoxy-5-ethylphenyl)-4-(4-Bromophenyl) isoxazole) that inhibited migration of MDA-MB-231 with an IC50 of 5 nM and 50 nM, respectively. I synthesized KRIBB3 (5-(5-ethyl-2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-(4-methoxyphenyl) isoxazole) by replacing bromide group of CBI-0997 with methoxyl group. Like CBI-0997, KRIBB3 has anti-migratory and anti-invasive activity for MDA-MB-231. Because KRIBB3 has better drug-like structure, I focused my effort to understand its anti-migratory mechanism further. Biotinyl-KRIBB3 was synthesized as an affinity probe for identification of KRIBB3-binding proteins. Using affinity chromatography, Hsp27 was identified as a target protein of KRIBB3 in vitro. Treatment of MDA-MB-231 with PMA induced PKC-dependent phosphorylation of Hsp27 and tumor cell migration. In contrast, treatment of MDA-MB-231 with KRIBB3 blocked PMA-induced phosphorylation of Hsp27 and tumor cell migration. Furthermore, overexpression of Hsp27 could antagonize inhibitory effect of KRIBB3 on tumor cell invasion and knockdown of Hsp27 using siRNA inhibited tumor cell migration. Overall, my results demonstrated that KRIBB3 inhibits tumor cell migration and invasion by blocking PKC-dependent phosphorylation of Hsp27 through its direct binding to Hsp27.

During the test of anticancer effects by KRIBB3, I found that KRIBB3 inhibited cell proliferation in several cancer cells. Especially, HCT-116 cells were inhibited cell growth with a GI50 of 0.35 μM. Flow cytometry study showed that KRIBB3 caused cell cycle arrest at G2/M phase and apoptosis. This was confirmed by detecting accumulation of Cyclin B1 and cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). While transient inhibition by KRIBB3 leaded to reversible mitotic arrest, prolonged exposure to the KRIBB3 induced apoptosis. Co-immunoprecipitation assay showed that KRIBB3 initially induced association of inhibitory Mad2 with p55CDC (mammalian homologue of CDC20), activator of APC/C (anaphase-promoting complex/cyclosome), suggesting that mitotic spindle checkpoint was activated by KRIBB3. However, this inhibitory complex of Mad2 with p55CDC was gradually decreased 24 h after KRIBB3 treatment and was hardly detectable after 48 h, indicating slippage of mitotic checkpoint. Consistent with these observations, KRIBB3 activated the mitotic spindle checkpoint by disrupting microtubule cytoskeleton. KRIBB3 was proven to be a tubulin inhibitor using in vitro polymerization assays and in vivo indirect immunofluorescence staining. The temporal pattern of Bax activation by KRIBB3 was similar to PARP cleavage, suggesting that Bax is a mediator of KRIBB3-dependent apoptosis. Furthermore, when KRIBB3 was administered intraperitoneally into nude mice at 50 mg/kg or 100 mg/kg, it inhibited 49.5% or 70.3% of tumor growth, respectively. These results suggest that KRIBB3 is a good drug candidate for cancer therapy.