Direct amplification from various biospecimens using a novel PCR buffer system

Abstract

[한글]다양한 생체 시료에서 DNA를 증폭하는 기술인 중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR)은 분자 생물학과 분자 진단 등 다양한 매우 다양한 분야에서 이용되고 있는 핵산 증폭 기술이다. 그러나, PCR을 통해 유전자를 증폭하기 위해서 필요한 가장 중요한 부분은 원하는 주형 DNA를 순수하게 얻는 과정이다. 시료에서 DNA의 정제 과정 없이 바로 PCR을 진행 할 경우에는 이들 시료에 함유되어 있는 다양한 내부, 외부 성분들에 의한 PCR 활성 억제가 이루어지므로, 원하는 결과를 얻을 수가 없게 된다. 최근에 우리는 다양한 상황에서도 시료에서 DNA를 정제하지 않고 바로 유전자 증폭이 가능하도록 DNA 중합효소의 활성을 보호하는 용액 AnyDirect를 개발하였다.

여러 종류의 DNA 중합효소에서도 AnyDirect 용액을 사용할 경우 혈액에서 유전자 증폭이 가능하다. 또한, high GC를 갖는 유전자의 증폭에도 betaine 등과 같은 첨가제의 추가를 통해 유전자 증폭을 수행할 수 있다. 중요하게는 혈액 내에 적은 copy 수의 주형 DNA를 갖는 경우에도 효과적으로 증폭이 가능하다는 사실이다. 또한, AnyDirect를 이용한 직접 핵산 증폭 결과물이 다양한 추가 반응에 이용이 가능여부를 확인하기 위해 다양한 apolipoprotein E (apo E)의 genotyping 반응 [sequencing, SNaPshot assay, PCR- restriction fragment length polymorphism (RFLP) 와 allele specific (AS)-PCR 등]에 응용 하였다. 또한, 우리는 하나의 반응으로 apo E genotype을 확인할 수 있는 새로운 방법인 다중 반응 tetra-primer amplification refractory mutation system (T-ARMS) PCR법을 고안하였고, AnyDirect를 이용할 경우 혈액에서 바로 apo E genotyping이 가능하였다. 이 방법은 DNA 정제와 다른 처리과정 없이 바로 혈액을 이용하여 단 한번의 반응을 통해 apo E genotype을 확인할 수 있는 방법으로, 간편하고 빠르며, 또한 정확한 결과를 얻을 수 있는 방법이다.

식물체는 단단한 세포벽을 가지고 있으며, 또한 polyphenol 화합물들과 같은 다양한 내부 PCR 억제제들을 함유하고 있으므로, 이들에서 DNA를 정제 하는 과정은 매우 복잡하고 힘든 작업이다. 따라서, 우리는 간단한 lysis 방법의 고안을 통해 식물체에서 보다 간편하게 PCR 결과를 얻을 수 있는 방법을 설계하였다.

이와 같이 AnyDirect 용액을 이용한 다양한 실험 과정들은 여러 생체시료들을 이용하여 간단하고, 간편하며, 위험성이 적고, 경비가 절약되면, 빠른 유전자 증폭과정들로 DNA 정제 과정을 생략하므로, 유전질환이나 감염성질환을 확인하는데 매우 유용한 방법이다. 그리고 DNA 정제 과정의 생략은 다량의 시료를 손쉽게 처리할 수 있는 방법을 제공하고, lab-on-a-chip 기술등과 같이 bio-MEMS 기술과 연결될 경우 매우 유용한 기술로 발전할 수 있을 것으로 여겨진다

[영문]Polymerase chain reaction (PCR) using DNA from various biospecimens, such as blood, plant, tissue, etc, is a valuable tool in the field of molecular biology and medical diagnostics. However, DNA isolation from biospecimens is a laborious and sample-consuming step, and hampers the automation of PCR for large-scale studies. And attempt to PCR from biospecimens without DNA isolation is not achieved, since numerous endogenous and exogenous constituents may inhibit PCR. We used a novel buffer system, ‘AnyDirect’ that conserves the enzymatic activity of DNA polymerases for effective use in direct PCR from biospecimens under various conditions

Using AnyDirect, DNA amplification was achieved from whole blood with a variety of thermostable DNA polymerases. Amplification occurred regardless of target size (up to 1.7 kb), presence of various known PCR inhibitors, and high target GC content. Importantly, low copy number DNA targets were effectively amplified from whole blood.

The downstream procedures from direct PCR using AnyDirect were examined with various apolipoprotein E (apo E) genotyping methods such as sequencing, SNaPshot assay, PCR- restriction fragment length polymorphism (RFLP), and allele-specific (AS)-PCR. In this study, we have also developed a new genotyping method for apo E. Our multiplex tetra-primer amplification refractory mutation system (multiplex T-ARMS) PCR was performed in a single reaction tube and gave definitive electropherograms at each genotypes. Using AnyDirect solution, multiplex T-ARMS PCR for apo E genotyping from whole blood is a simple, rapid, and accurate method that requires only a single PCR reaction without DNA extraction and any another treatments or expensive instrumentation.

The extraction of PCR-compatible genomic DNA from higher plants requires complicated and tedious work because plant cells have rigid cell walls and contain various endogenous PCR inhibitors such as polyphenolic compounds. Therefore, we developed a simple lysis system that can give rise to an appropriate template for direct PCR with AnyDirect solution, making the direct amplification of DNA fragments from plant leaves possible.

Our experimental procedure provides a simple, convenient, non-hazardous, non-expensive, and rapid process for DNA amplification from various biospecimens. And our AnyDirect solution allows direct PCR from whole blood and may facilitate detection of genetic diseases or infections by eliminating the time and effort for DNA extraction. The use of AnyDirect could facilitate the development of high-throughput PCR for large-scale diagnostic screening or investigation of various medical conditions. And this method may be applicable for use with lab-on-a-chip and bio-MEMS technology