Phi C31 Integrase를 利用한 副甲狀腺 호르몬의 實驗的 遺傳子 治療

Abstract

[한글]

目的: 遺傳子 治療法에 있어 治療 遺傳子, 卽 標的 遺傳子를 細胞內 特定 部位에 傳達하기 위해서는 安全하고 效果的인 遺傳子 傳達體系가 必須的이다. 現在까지의 遺傳子 傳達體系는 바이러스性 遺傳子 傳達體系와 非바이러스性 遺傳子 傳達體系로 大別할 수 있는데, 前者가 效果的이고 效率的으로 比較的 큰 規模의 遺傳子를 體內에 導入할 수 있는 長點을 가지고 있는데 反해, 바이러스의 感染이라는 生物學的인 危害는 恒常 醫學的인 憂慮를 惹起하며, 또한 導入 部位의 任意性으로 因한 突然變異의 發生도 安全性을 確保하는데 어려움을 더하고 있다. 한편 非바이러스性 遺傳子 傳達體系는 生物學的인 危害는 克服할 수 있는데 反해, 遺傳子 導入의 效率面에서 極히 制限이 있어, 效果的인 遺傳子 治療를 위해 克服해야 할 課題가 남아있다. 따라서 生物學的으로 安全하고, 效率面에서 效果的인 새로운 遺傳子 傳達體系의 確立이 要求된다. 이에 Phi C31 integrase라는 박테리오파지의 酵素를 利用한 새로운 遺傳子 傳達體系의 確立을 위한 硏究를 施行하고, 副甲狀腺호르몬低下症에 對한 遺傳子 治療에 適用해보고자 한다. 方法: 副甲狀腺호르몬 cDNA와 attB 部位를 包含하는 플라스미드 벡터를 製作하여, 이를 integrase 플라스미드 벡터와 함께 293細胞에 遺傳子를 導入하여, 副甲狀腺호르몬의 分泌를 測定하였다. 그리고 이 細胞로부터 遺傳體를 抽出하여 標的 遺傳子가 願하는 部位에 正確히 揷入이 되었는지를 確認하였다. 以後 hydrodynamic法을 利用하여 마우스의 꼬리 靜脈에 副甲狀腺호르몬 cDNA와 attB 部位를 包含하는 플라스미드 벡터와 integrase 플라스미드 벡터를 함께 注入한 後 週期的인 靜脈 採取를 通해 血淸 副甲狀腺호르몬의 濃度를 測定하였다. 그리고 마우스의 肝에서 遺傳體를 抽出하여 標的 遺傳子가 願하는 位置에 正確히 揷入이 되었는지 確認하였다. 結果: 293細胞와 마우스의 靜脈血에서 모두 副甲狀腺호르몬의 過多分泌가 確認되었고, 293細胞와 마우스의 肝에서 抽出한 DNA에서 副甲狀腺호르몬 cDNA가 正確한 位置에 揷入되었음을 確認하였다. 結論: Phi C31 Integrase를 利用한 遺傳子 傳達體系는 旣存의 바이러스性 遺傳子 傳達體系와 非바이러스性 遺傳子 傳達體系가 가지고 있던 生物學的인 不安定性 및 非效率이라는 短點을 補完하는 劃期的인 遺傳子 傳達體系의 한가지 方法으로 提示할 수 있다. 이를 利用한 副甲狀腺호르몬 遺傳子 治療는 그 應用 價値가 充分히 있을 것으로 思料된다. 다만 血液內 칼슘 濃度에 따른 副甲狀腺호르몬의 分泌 調節 機能의 不在는 칼슘認知受容體를 利用하여 補完해 나가야 할 것이다.

[영문]Overview Gene delivery system plays an essential role in gene therapy. To be clinically useful for gene therapy, nonviral gene delivery system must avoid the rapid vector loss characteristic of plasmid-based approaches. Phage integrases can be a potential alternative to overcome the inefficiency of nonviral vector. Phage integrases mediate unidirectional site-specific recombination between two DNA recognition sequences, the phage attachment site, attP, and the bacterial attachment site, attB. In other words, in nature, the integrase mediates unidirectional recombination of the phage genome into the bacterial chromosome through a site-specific reaction between attB and attP sites. In the mean time, hypoparathyroidism occurs most after thyroidectomy, and sometimes as an idiopathic disorder. The treatment of hypoparathyroidism has been classically the replacement of calcium and vitamin D. Recently, replacement of parathyroid hormone(PTH) is reported to be a more physiologic treatment option. Because of the difficulty of preparation and the cost of PTH proteins, PTH gene therapy is preferred, which can replace PTH for a much longer period. We showed in this experiment that Phi C31 integrase(int) achieved site-specific genomic integration of PTH gene into the genomes of the human cell-lines and adult mice.Method We constructed the plasmid that contained the PTH cDNA and attB site. It was cotransfected in the 293 cell-line with/without the int plasmid. Then we checked the expression and secretion of PTH and site-specific integration of the PTH into the genome of the cell-line by pseudo-site rescue analysis. In in vivo experiment, we injected the PTH and attB plasmid with/without the int plasmid via mouse tail vein with hydrodynamic pressure method. Then we checked the PTH concentration in blood serially, and obtained genomic DNA from the mouse liver to confirm the site-specific integration of the PTH into mouse genome.Result PTH was well expressed and secreted from the 293 cell-line and mouse hepatocyte, and pseudo-site rescue analysis confirmed the site-specific and efficient integration of the PTH plasmid into the host genome.Conclusion The properties of site-specificity and efficiency make integrases have an impact in many areas, including creation and manupulation of cell-lines and transgenic organisms and potenial gene therapy. PTH gene therapy is one candidate, however, we need to adopt the regulation system of PTH secretion such as calcium sensing receptror in future.